[发明专利]一种NAD激酶变体基因及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种NAD激酶变体基因及其用途。属于生物化工技术领域。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸又称为三磷酸吡啶核苷酸是一种广泛参与生命体氧化还原代谢及其它一系列生物化学反应的氧化性辅酶,在生物氧化过程中作为氢传递体，以还原态NADPH形式参与脂类，核苷酸以及脂肪酸等合成，是生物体内不可缺少的重要辅酶。

在生物体内，NADP的产生基本通过NAD激酶利用ATP或多聚磷酸盐作为磷酸供体催化NAD+发生磷酸化获得。NAD激酶在生物体内通常分为两类，一类是能以ATP和poly(P)作为磷酰基供体催化NAD+发生磷酸化的ATP/poly(P)-NAD激酶；而另一类仅以ATP作为磷酰基供体的酶催化NAD+发生磷酸化的ATP-NAD激酶。

NAD激酶的发现最早是在1950年，Kornberg从酵母酿酒细胞获得，之后在产朊假丝酵母等许多物种中均获得了NAD激酶。2000年Kawai等首次鉴定了结核分支杆菌H37RV的poly(P)/ATP-NAD激酶PpnK激酶基因，他们发现这一酶能催化NAD+生成NADP+。最近发现在嗜热脂肪地芽孢杆菌体内存在一个NAD激酶（对应基因NADK），是仅以ATP作为磷酰基供体的酶，能催化NAD+发生磷酸化的ATP-NAD激酶.但目前来源于该菌的NAD激酶催化能力还不够高，大规模产业化生物合成NADP+还有一定困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种NAD激酶变体基因及其用途，克服现有NAD激酶在催化合成NADP+过程中催化活性差的缺点。本发明获得的NAD激酶变体基因所表达的NAD激酶变体酶对NAD+具有更高催化活力，与具有NAD激酶基因所表达的NAD激酶相比较，催化效率上升了1-1.5倍。该变体基因的获得为NADP+的生物生产提供了广阔的应用前景。

本发明技术方案是这样实现的：

一种NAD激酶变体基因，利用易错PCR技术对NAD激酶基因进行随机突变，通过筛选获得，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶基因中的编码第43位的原脯氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，第182位的原丝氨酸的密码子突变为精氨酸的密码子。

一种NAD激酶变体基因的用途：所述变体基因通过基因工程技术重组表达NAD激酶变体酶，可用于催化NAD+生成NADP+。

本发明利用定向进化中的易错PCR技术对NAD激酶基因进行随机突变，根据NAD激酶基因设计一对引物，通过降低传统PCR中四种dATP、dGTP、dCTP和dTTP中任意两种的浓度并且加入一定量的MnCl2，使基因在体外扩增时随机错误引入突变获得突变基因文库，并通过一定的筛选方法获得一种NAD激酶变体基因，按此设计思想，以pET30α(+)nadk作为模板DNA，采用易错PCR定向进化技术获得易错PCR扩增产物，经NdeI–BamHI双酶切易错PCR扩增产物后，提取大小约为816bp的基因产物并与同样的酶双酶切后的大小大约为5423bp的线性质粒pET30α(+)进行连接反应,连接完毕后将连接产物转化E.Coli BL21中，涂布到到含有40μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。