[发明专利]一种利用菜籽粕产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产纳豆激酶细菌纳豆芽孢杆菌及其应用。 

背景技术

纳豆激酶(nattokinase,NK)是由纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto,BN）产生的一种丝氨酸蛋白酶,具有强烈的溶栓功能和抑制血栓形成的功能；同时能抵抗胰蛋白酶水解作用,在肠道内稳定性好,易被人体消化吸收；另外具有无毒无副作用，体内半衰期长的优点，无论是将纳豆激酶作为抗血栓药物，还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品都有十分重要的开发价值。 

在发酵生产中，优良菌株是提高发酵产量和质量的关键要素之一，因而用于发酵纳豆激酶的菌株的性能就显得至关重要。基因组改组（Genome shufling）是一项对整个微生物全基因组进行重排的定向育种技术，它把传统微生物诱变育种技术与细胞融合技术结合，通过诱变手段获得若干正性突变株，并采用细胞融合方式使之全基因组发生重组，经过递推式多次融合，使基因组在较大范围内发生交换和重排，将引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中，最终获得具有多重正向进化标记的目标菌株。由于Genome shuffling技术克服了某些菌株因经过多年诱变、对理化诱变因素已不太敏感的缺点，以及基因工程育种技术操作复杂、设备要求高的缺点，是适于改善工业微生物表型的直接有效技术，在菌种选育过程中已呈现出良好的应用发展前景。另外我国作为油菜籽产量居世界之首的大国，每年油脂加工后所产生的菜籽粕达600-700万吨。菜籽粕粗蛋白质含量为33％-40％，是一种来源广泛、价格低廉、营养价值很高的全价蛋白资源。 

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种纳豆芽孢杆菌及其应用。 

本发明以湖南农业大学食品科技学院507实验室保藏的菌株纳豆芽孢杆菌Z1为出发菌，采用传统诱变育种和筛选方法获得紫外诱变菌株，命名为U49，和微波诱变菌株，命名为W51，然后以紫外诱变菌株U49和和微波诱变菌株W51作为亲本菌株，进行亲本菌株基因融合，再经过反复筛选后获得了一株产纳豆激酶性能稳定的优良菌株F22，命名为纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），已保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国.北京，邮编：100101，保藏日期：2013年6月28日，保藏编号：CGMCC7825，F22菌株可应用于制备生产纳豆激酶的生物制剂。 

下面结合选育过程及优点对本发明作进一步说明： 

取发菌株纳豆芽孢杆菌Z1菌悬液，用紫外线照射60s进行紫外诱变后涂布平板（发酵培养基：蔗糖2%，菜籽粕2%，K₂HPO₄0.4%，KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.05%，NaCl0.5%，调节pH为7.2±0.2，121℃灭菌20min），经过酪蛋白琼脂平板法测定透明圈进行初筛，再采用福林-酚法和琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定纳豆激酶活性进行复筛，得到正突变纳豆芽孢杆菌菌株U49，其纳豆激酶酶活为1329.62IU/mL，比出发菌株Z1提高了100.34%。并且突变菌株U49的产酶性状是稳定的，可作为基因重组育种理想的亲本菌株。 

取出发菌株纳豆芽孢杆菌Z1，在常规自然制冷样品处理条件下，微波诱变处理0s、10s、20s、30s、40s、50s，涂布平板（发酵培养基：蔗糖2%，菜籽粕2%，K₂HPO₄0.4%，KH₂PO₄0.2%，MgSO₄0.05%，NaCl0.5%，调节pH为7.2±0.2，121℃灭菌20min），挑选出72个突变株，经过酪蛋白琼脂平板法测定透明圈进行初筛，再采用福林-酚法和琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定纳豆激酶活性进行复筛，得到正突变株W51，其相对纳豆激酶活力值为735.19IU/mL，比出发菌株Z1提高了42.69%。将突变菌株W51传代5次，其纳豆激酶活力基本稳定，具有良好的遗传稳定性，可作为基因重组育种理想的亲本菌株。 

通过基因组改组技术对突变株U49和W51进行原生质体亲本融合，然后以筛选出的菌株作为亲本再次进行原生质体融合并筛选，经3次融合处理后，筛选出酶活最高的一株F22，将U49、W51、F22和出发菌株Z1同时测酶活，得知与菌株Z1比较，3个菌株的酶活提高率分别为：101.49%、46.58%、265.82%。经过传代，融合子菌株F22进行连续传代培养测其纳豆激酶活性稳定。