[发明专利]一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养的方法。 

背景技术

间充质干细胞（MSC）是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的成体干细胞。因其具有免疫调控、分泌细胞因子、取材方便等优点而倍受关注，成为细胞治疗的理想种子细胞。间充质干细胞研究日益受到广泛关注并显示出越来越广阔的应用前景，在细胞治疗、组织工程等领域具有极为重要的应用价值。是继造血干细胞之后临床应用研究最多，也是最成熟的一种成体干细胞。从 1995 年首次报道MSC 应用于临床试验，现在培养的MSC 已被广泛地用于临床试验研究，如移植物抗宿主病（GVHD）、充血性心衰、急性心梗、2 型糖尿病、脊髓损伤、软骨和骨损伤、克罗恩病等，而且在肾脏、肌肉和肺的损伤修复中也有初步进展。 

不管是来源于骨髓还是其他组织的间充质干细胞原始数量都是很有限的，要达到临床应用的细胞数量级，就必须经过体外的扩增培养。培养基是MSC培养效率和安全的关键。选择使用的培养基要求能够维持MSC在经过数次传代培养后的表型，基因稳定和功能。 因此必须采用优化的培养条件。常用DMEM或αMEM添加动物血清（胎牛血清FBS）或人血清或血浆和生长因子。但在培养过程中，血清蛋白能细胞内化而残留在细胞的胞浆中，由此可能会导致患者过敏反应，以及可能引起如疯牛病（BSE）、克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）等疾病。因此临床研究用MSC需要在无血清的条件下培养扩增。 

现有的无血清培养基主要通过添加大量的生长因子来维持细胞的生长繁殖。但是因为MSC是贴壁生长的细胞，无血清培养基缺乏各种粘附贴壁因子如纤连蛋白（FN）等而不能很好贴壁。目前国际上几家大生物公司研究的几款无血清培养基如（加拿大STEMCELL公司的MESENCULT，德国LONZA公司的MSCGM-CDT，美国GIBICO公司的STEMPRO MSC SFM CTS蛋，德国PAN公司的POWERSTEM MSC1等），以及现有专利（201110420539.9）都是通过添加预先用纤连蛋白或其他专用试剂预先包被培养皿，或在培养基中添加大量的纤连蛋白来保证间充质干细胞的贴壁生长。现有方案的缺点是：1）需预先包被培养皿工作量大，不适用大规模培养。2）需用特殊蛋白如纤连蛋白FN，价格昂贵，1g约100万人民币。3）重组的FN只是片段，不完全具有全部FN的功能。4）重组的FN还需要保证其生物安全，未被其它基因污染等。所以基于此的无血清培养基价格昂贵，使用不方便，使得其普及性十分低。 

  

发明内容

本发明的目的提供一种简便、成本低且安全性高的方法，有效地解决间充质干细胞在无血清培养基中的贴壁问题。 

本发明的技术方案如下： 

一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，其特征在于：在基础培养基中添加刺激药物凝血酶，刺激间充质干细胞自身分泌内源性纤连蛋白。

其中，所述的基础培养基包括αMEM，DMEM，或其他无血清培养基。 

所述的刺激药物凝血酶浓度为0.1~20 IU/mL，使用的凝血酶为临床药品级。 

所述的刺激药物凝血酶浓度优选为0.25~10 IU/mL。 

所述的间充质干细胞的组织来源包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪、羊水、羊膜、血管。 

本发明主要是通过用在基础培养基中添加凝血酶，通过凝血酶与间充质干细胞上的蛋白激酶受体结合，激活NFκB和ERK信号通路，促进间充质干细胞合成和分泌纤连蛋白，增强间充质干细胞贴壁能力，同时不改变间充质干细胞的生物学特性。 

本发明的显著优点： 

1）    本发明的培养基中不含动物源血清，不含人源血清。

2）    本发明利用MSC自身分泌大量的纤连蛋白，实现MSC在无血清培养基中的贴壁生长。 

3）    本发明还可以促进MSC在无血清培养基中的增殖。 

4）    本发明使得内源性FN分泌增多，内源性FN生物学功能优于重组的FN片段。有利于间充质干细胞更好的维持自我更新的干性。 

5）    本发明添加的刺激物来自临床药品，适用于临床研究级的间充质干细胞在无血清中培养扩增，及临床治疗应用。 

6）    通过本发明的方法培养的间充质干细胞维持其生物学特性，具有多向分化能力。 

7）    本发明经济，简便。 

  

附图说明

图1为对照组（Control）与凝血酶组（Thrombin）分泌纤连蛋白(FN)量的比较。