[发明专利]一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法

权利要求书

1.一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，其具体步骤为：

(1).根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计的环介导等温扩增引物；

(2).提取待检测样品DNA及阳性对照鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA、或含检测靶序列的重组质粒DNA；

(3).鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测的反应体系组成如下：

2xU-LAMP反应混合液10μl，其组成为：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH₄)₂SO₄、10mM MgSO₄、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；10x引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，BIP为12μM，FIP为12μM，LF为3μM，LB为3μM，；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl，同时设置阴阳性对照扩增体系，阴阳性对照扩增体系除模板外，其余成分同上述检测反应体系；

(4).特定的程序为：64.0℃45min→80℃5min→-20℃保存；

(5).LAMP反应结束LAMP反应结果进行的分析及判定的方法包括：

①肉眼直接观察反应浊度

②琼脂糖凝胶电泳分析

③肉眼观察反应液颜色的变化.

所述述3种方法中可选一种或多种作为判断标准，其中：

①肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化：在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg²⁺结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大，在反应结束后，可直接通过肉眼判读，反应液出现浑浊沉淀，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；

②琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；

③加入1/1000的Sybrgreen I染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光：如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性；反之，则为阴性。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，利用环介导等温扩增技术扩增鼠伤寒沙门氏菌的特定靶核酸序列区域。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的阴阳性对照扩增体系中，阳性对照模板为含有鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA或含检测靶序列的重组质粒DNA，阴性对照的模板为灭菌超纯水，并使用电泳分析或Sybrgreen I荧光染料紫外灯下显色同时检测阴阳对照扩增产物。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，针对鼠伤寒沙门氏菌中的Genbank登录号为NC_003197.1的STM4493基因设计环介导等温扩增特异性引物。