[发明专利]一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋藻类多糖的研究与开发，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法及其应用，属于海洋生物技术领域。

背景技术

海洋面积辽阔，海洋藻类植物来源丰富，海藻多糖正逐步成为生物多糖的主要来源之一。海藻多糖具有很高的药用价值，在提高人体非特异性免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、降血糖、降血脂方面具有显著的作用。海藻多糖中的活性物质多为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸等单糖组成的水溶性酸性、中性多糖。

目前多糖提取采用了不同的方法，包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、微波法等。提取后粗多糖中蛋白质和色素的脱除同样是其分离工程中的重要步骤之一。目前多糖脱除蛋白质和色素往往采用化学法，继而采用轴向色谱DEAE层析进行分级纯化，但存在产品产量低、耗时长、分离效率低、压降大等缺点，特别对于海藻粘性多糖，轴向色谱分离易造成压降大，效率低下。径向流色谱是一种新型色谱分离纯化技术，独特的径向流动设计，使其相对于传统的轴向色谱，具有流速高、操作压力低、线性放大等优势。

裂片石莼属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属。石莼是重要的大型经济藻类，广泛分布于西太平洋沿海地区，在我国沿海均有分布，市场上价格便宜，其中含有的多糖多为粘性多糖，粘性系数高。

肿瘤严重威胁人类健康，临床上治疗该疾病的药物，一般都是化学合成的抗肿瘤药，通常具有一定的毒副作用。从植物、微生物及海洋生物中提取的天然药物具有安全低毒副作用、生物相容性好、可生物降解的优点。近年来抗癌上市的新药中，60%来自天然产物。多糖类化合物的活性存在一种间接的抗肿瘤活性，即由免疫体系传递的活性，因此毒性极小，不会对人体造成伤害。采用化学方法分离纯化多糖往往反应条件剧烈，会导致多糖构象发生变化，活性基团易受破坏，产物质量不稳定等缺点，进而严重影响多糖生物活性。

公开号为CN200610026830.7公开了一种蜈蚣藻多糖提取物在制备抗肿瘤及其它药物中的应用，但该方法只涉及蜈蚣藻粗多糖的提取，并没有将其进行进一步的纯化分离。公开号为CN101921346A公开了一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，该方法提供了一种将径向流色谱应用于粗多糖分离的方法。公开号为CN101709094A公开了一种超滤膜分离甜茶多糖的方法，该方法前期预处理需进行脱色素等步骤，且经过两次不同规格的超滤膜超滤，才能获得不同分子量多糖。

发明内容

本发明的内容在于提供一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法，并提出所制得的石莼硫酸多糖可作为抗肿瘤药物的新用途。

本发明的提取分离方法主要是超声波水提醇沉获得裂片石莼粘性粗多糖；径向流色谱技术脱盐脱蛋白；按照分子量大小超滤处理，分离出10KD至30KD裂片石莼多糖组分；再继续经过径向流离子交换分离多糖组分，获得目的多糖产物。其中多糖目的产物具有明显抗肿瘤活性。

本发明采用的技术方案是：

一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将裂片石莼洗净、干燥后粉碎，过100目筛，得颗粒均匀的粉碎物；

(2)称取步骤(1)得到的粉碎物，加入质量为粉碎物60～70倍的蒸馏水，在400-500W的超声条件下提取30～40分钟，然后冷却静置（通常静置1～2h），离心分离，取上清液a；

(3)将步骤(2)得到的上清液a旋转蒸发浓缩至体积为原体积的10%～15%，加入体积分数95%的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为80%，静置10～20小时，离心分离，所得沉淀冷冻干燥，得粗多糖a；

(4)将步骤(3)得到的粗多糖a加水配制成质量浓度5～10mg/ml的溶液，离心分离后，取上清液b过0.45μm微孔滤膜，得滤液b；

(5)将步骤(4)得到的滤液b加入装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样后用蒸馏水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/（min·cm），洗脱速度/柱高为8-12ml/（min·cm），洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，表示洗脱完毕，收集所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥得粗多糖b；