[发明专利]一种染色鉴别泡菜生花真菌性病原菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品技术领域，具体是提供一种简单且准确的利用染色鉴别泡菜生花真菌性病原菌的方法。

背景技术

泡菜是指将蔬菜经过预处理后直接浸泡在一定浓度的食盐溶液中通过自身所含微生物或人工接种的乳酸菌进行乳酸发酵并伴随着酒精发酵和醋酸发酵而形成的有特殊风味的发酵制品泡菜的制作方法简单成本低廉风味独特口感好是大众所喜欢的腌制菜之一同时泡菜还有抗菌、净肠、预防动脉硬化、减肥和抗衰老等作用。

泡菜中的微生物有多种，其中乳酸菌对泡菜品质起着决定性的作用，而其他杂菌(如肠杆菌霉菌等)会破坏泡菜的品质，这些腐败菌产生的毒素和亚硝酸盐等会危害人的健康。“生花”病害就是泡菜生产过程中最常见的病害之一。“生花”也叫产膜，俗称“臭风”，常出现在啤酒、酱油、果汁、葡萄酒及泡菜的生产过程中。泡菜在发酵过程中，表面飘浮一层白色膜状物质，并使泡菜带有不愉快气味，发酵时间延长，且容易引发一系列其它变质现象。生产现场调查表明：泡菜“生花”对泡菜风味影响很大，泡菜会散发一种令人不愉悦的气味，而且会产生涩味，口感比正常发酵泡菜差很多。

目前，国内外还没有学者对泡菜“生花”进行比较系统的研究。人们对泡菜“生花”的认识主要还停留在生产过程中遇到的“生花”现象，引起泡菜“生花”的病原菌以及其作用机理尚未见详细报道。食品的品质很大程度上与所含微生物的数量有关，其所含有害微生物越多，品质越差，对人体健康越有危害大部分微生物是病原微生物，与人类的发病和传播有密切关系，在食品制造中，应尽量减少有害微生物的数量。在实际生产中，鉴别生花泡菜的方法只能依靠工人的生产经验人工进行病害泡菜的挑选和分离。真菌性病原菌是生花病害常见的危害菌和重要污染指标。

因此提供一种简单且准确的鉴别泡菜生花真菌性病原菌的方法具有非常重要意义。

发明内容

本发明通过观察疑似“生花”真菌性病原菌的细胞核和子囊孢子染色的结果，对该病害微生物进行鉴定。技术方案分为细胞核的染色鉴定和子囊孢子的染色鉴定两部分，具体为一种染色鉴别泡菜生花病害微生物的方法，包括细胞核的染色鉴定和子囊孢子的染色鉴定；

所述细胞核的染色鉴定步骤为：菌悬液涂片→干燥→石油醚脱蜡→乙醇溶液冲洗→苏木精液染色32～40min→水洗11～15min→酸水或酸乙醇分色→乙醇或水冲洗数小时→置碱水或碱乙醇中变蓝→1.2～1.5％伊红溶液复染→各级乙醇脱水→二甲苯透明→镜检；

其中，制片脱蜡后用乙醇溶液冲洗，先用无水乙醇冲洗，再分别用浓度递减的乙醇溶液冲洗，直至用蒸馏水冲洗；分色和碱液变蓝过程使用酸液和碱液来完成；复染后，用浓度从低到高直至无水乙醇进行脱水。

所述子囊孢子的染色鉴定步骤为：将疑似菌接种于孟加拉红液体培养基→30～40℃恒温培养25～36h→连续转接2次→再转接到肉汁蛋白胨培养基中→25～28℃恒温培养4～7d→取菌悬液涂片→干燥→饱和孔雀绿水溶液染色12～15min→水洗→0.5％番红复染35s～40s→水洗→干燥→镜检→低倍镜→高倍镜→油镜；

观察芽孢染色结果，染色后，菌体呈微红色，若有芽孢则芽孢呈绿色。

本发明通过对疑似生花真菌性病原菌的细胞核和子囊孢子进行染色的结果与已确认生花病害微生物进行比较，以此来对其进行鉴定。本发明方法具有实验简单、成本低廉、易操作实施、重复性好等优点。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

试验原料和试剂

1)泡菜疑似菌：从泡菜中分离出“生花”细菌性病原疑似菌5株，编号为B₁、B₂、B₃、B₄、B₅，分离出来的菌落表面粗糙，外围为白色整齐丝状，中心为红色，边缘整齐，中央稍凸起直径6～8mm；

2)Ehrlich苏木精液：用25ml乙醇及10ml醋酸将2g苏木精溶解，然后加100ml甘油，再加入其余75ml乙醇，将10g钾明矾溶于100ml水中，加热溶解，再将钾明矾溶液缓慢加到苏木精溶液中，并不时搅拌，混合后在光亮处放置3周左右，溶液呈红色；

3)乙醇、石油醚、酸、碱等常用化学试剂。

试验步骤：

菌悬液涂片→干燥→石油醚脱蜡→乙醇溶液冲洗→苏木精液染色32min→水洗1lmin→酸水或酸乙醇分色→乙醇或水冲洗数小时→置碱水或碱乙醇中变蓝→1.2％伊红溶液复染→各级乙醇脱水→二甲苯透明→镜检；