[发明专利]福尔马林固定石蜡包埋样本核酸萃取方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种核酸分离方法，特别是关于一种自福尔马林固定石蜡包埋样本中取得核酸的核酸分离方法。

背景技术

福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，简称FFPE）是目前最广泛采用的保存病理样本的方法。尤其对于临床病理诊断与病理机制研究而言，福尔马林固定石蜡包埋方法及组织样本更是不可或缺的必要工具之一。由于生物组织样本离体后，容易腐化难长久保存，而福尔马林固定石蜡包埋组织则提供了一完善的解决方法：经由适当的福尔马林固定石蜡包埋，样本得以充分保有其组织原貌，供长期保存；更可经由完善的归档，建构病理样本数据库，病理研究人员可回溯取得组织样本的状态，取得更充分的病理分析信息。

一般而言，福尔马林固定石蜡包埋组织较常应用于临床的病理切片，以各种组织染色方法加以处理，由直观的显微镜观察方法，诊察其组织型态与特殊生物分子（例如：蛋白质、核酸、骨质…等）的表现情况，从中获得大量信息，精确诊断或探究病理机制。然而，福尔马林固定石蜡包埋组织除了能提供上述信息外，福尔马林固定石蜡包埋组织中还保存了另一种藏有丰富珍贵信息的生物分子-核酸。在取得核酸后，配合进行聚合酶连锁反应（PCR）、反转录聚合酶连锁反应（reverse transcription-PCR或RT-PCR）、量化实时聚合酶连锁反应（quantitative real time-PCR或Q-RT-PCR）、微芯片分析（microarray）、免疫沉淀（immuno-precipitation）分析等各种分子生物学或免疫学技术的分析，测定病理组织中的基因表现，可更深入研究特定疾病的病理机转与对应的基因调控机制，对病理学的研究帮助甚深。

此外，近年来随着基因体研究的发展，延伸开发出「药学基因学」（Pharmacogenomics）的领域。简言之，由于每一个体之间，其基因上的微小差异却可能造成各个体对药物的代谢反应歧异，并导致截然不同的临床症状。因此，将个体的基因材料（核酸），应用至药物测试与药物作用机制研究，期望可针对各病患精确地侦测其对于药物的反应，有助于更准确地确立治疗方针。亦即，利用福尔马林固定石蜡包埋组织中的材料，可将临床征状与个体的分子、基因表现的诊察结果连结加以连结，提供更多且更精准的诊断信息。

由此可见，福尔马林固定石蜡包埋组织不仅在传统的病理分析上扮演着重要角色，其亦具备了长期汇集保存的优势，可系统性地提供丰富基因信息，更是未来医药研究的有力工具。因此，如何妥善且完整地从福尔马林固定石蜡包埋组织中分离出核酸，便成了首要达成的目标。

因此，为了自福尔马林固定石蜡包埋组织中取得生物组织，在进行实际的核酸萃取步骤的前，首要步骤便是移除包埋材料（石蜡），此步骤通常称为「脱蜡」（Deparaffinization）。然而，目前对于福尔马林固定石蜡包埋组织的处理方式，多数采取的前处理方法中均包含公知的有机溶剂脱蜡方法（参见图1的脱蜡方法流程示意图），简述如下：

步骤1′：二甲苯脱蜡：以纯二甲苯（Xylene）溶液或系列浓度（通常为70%至100%体积百分比）的二甲苯溶液，浸润福尔马林固定石蜡包埋组织，并多次置换二甲苯溶液（如采用系列浓度二甲苯溶液处理时，依序由最高浓度至较低浓度处理），以充分溶解石蜡，即可取得原包埋于石蜡中的生物组织。

步骤2′：乙醇置换：使用乙醇（100%体积百分比）浸润生物组织，并视需求增加置换的次数，以尽可能移除二甲苯溶液。

步骤3′：冲洗或复水（Rehydration）：是以乙醇或系列浓度乙醇（通常为70%至100%体积百分比，溶于纯水）浸润生物组织，以更进一步置换残留的二甲苯溶液，可选用直接以100%乙醇置换，或依序由最高浓度至较低浓度进行多次置换，以此充分洗去残余的二甲苯溶液，以执行后续核酸萃取与供核酸分析使用；此外，亦可根据使用者特定的需求与目的，将脱蜡后的组织回溶至水相溶液供后续使用。

于前述过程中，由于脱蜡后的组织是分散于溶液中，每次的置换与分离的程序均须依赖离心方法，使组织聚集于试管底，再将需要置换的溶液吸出排除。因此在繁琐的置换、离心与液体吸取过程中，生物组织流失的风险相对提高，不利于核酸分离的完整度与效果；此外，一般福尔马林固定石蜡包埋组织的采样量通常很少，前述的繁复程序所造成的不利影响更加显著。