[发明专利]一种耐热海藻糖合成酶融合酶突变体基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体是一种耐热海藻糖合成酶融合酶突变体基因及其应用，该基因表达的海藻糖合成酶可以用于生产海藻糖。

背景技术

海藻糖是由两分子葡萄糖以α,α-1,1糖苷键相连而成的非还原性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化(如脱水、高渗)变化后造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，因此被誉为“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，过去主要是从干酵母中提取，由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用，随着人类社会的发展和进步，希望能将海藻糖应用于日常生活所常用各类食品的鲜味保持与质地改善，更好提高人们的生活和健康水平，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。

海藻糖合成酶能够以麦芽糖为底物，将麦芽糖中的α,α-1,4糖苷键连接的麦芽糖转化为α,α-1,1糖苷键，麦芽糖转变成海藻糖，麦芽糖可以淀粉水解生成，因而海藻糖合成酶在工业化生产海藻糖中具有很强的竞争优势。

目前已有不少文献和专利报道了海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因的相关酶用于制备海藻糖，但这些海藻糖合成相关酶的合成途径不同，或者菌种来源不同，导致了DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量、酶学特性以及酶对底物的转化率，而且目前大部分还没有得到工业规模化的应用。

由于海藻糖酶转化麦芽糖生成海藻糖时一个可逆的反应，并随着反应温度的身高，海藻糖得率会降低，并会增加副产物葡萄糖的生成。目前克隆的海藻糖合成酶可以分成两大类，一种是中低温的海藻糖合成酶，如Thermobifida fusca和Pimelobacter sp.R48和其最适温度分别为25℃和20℃。一种是耐高温的海藻糖合成酶，如来自Thermus thermophilus的海藻糖合成酶，其最适反应温度为60-65℃。中低温的海藻糖合成酶的优点和耐热的海藻糖相比，在最适反应温度时，反应达到平衡时海藻糖的得率较高，低温的海藻糖合成酶反应产物中的海藻糖含量可以达到70%以上，如来自Pimelobacter sp.R48的海藻糖合成酶在25℃时，海藻糖的得率为76.7%，来自Thermobifida fusca在20℃时，海藻糖的得率为68.8%，在30℃时，海藻糖的得率为60.0%。而耐热的海藻糖合成酶，如来自Thermus thermophilus的海藻糖合成酶在65℃时，海藻糖得率为61.6%，虽然反应温度降低到20℃时，可以使海藻糖得率提高到76.0％，但需要反应速度大大减低。虽然中低温的海藻糖合成酶具有在底物转化率高的方面具有优势，但随着温度的升高，其底物的转化率会急剧下降，而且会产生较多的副产物，对低温的保温条件要求较高。耐热海藻糖合成酶的热稳定性较高，在高温下还能保持很好的催化活性，在生产中能适应生产的不稳定条件，酶的活力在高温条件下不易失活，可以保持长时间的催化能力，有利于提高酶的利用效率。此外耐热酶可以在较高的温度下进行反应，可以减少降温所需的耗能，而且还可以一定程度上防止杂菌的污染，这些优点度有利于降低生产成本。虽然耐热的海藻糖合成酶具有最适反应温度高和热稳定性好的特点，但由于在较高的反应温度条件下，会增加副产物的葡萄糖的生成，从而降低底物的转化率，同时耐热耐热的海藻糖合成酶也存在酶分子量大，反应速度慢的特点。因此耐热且海藻糖得率高的海藻糖合酶在海藻糖的工业生产中降低生产成本具有重要的意义。

本研究小组从玫瑰链霉菌和其它链霉菌中鉴定了多个海藻糖合成酶基因，并发现来自瑰链霉菌的海藻糖合成酶具有底物转化率高，反应速度快的特点，在20-25℃的反应条件下，底物的转化达到80％以上，见中国专利一种玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，申请号201210011457.3。

发明内容