[发明专利]一种复合种子细胞的组织工程神经的制备方法

权利要求书

1.一种复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

1）取离体的异种动物的外周神经组织，剔除其中的神经外血管、脂肪及结缔组织之后，用胰蛋白酶处理；胰蛋白酶处理完成后终止消化，使用低渗处理液对神经组织进行低渗处理；

2）将低渗处理后的神经组织在SB-10溶液中震荡浸泡12h以上，清洗后转入含有Triton X200和SB-16的混合液中震荡浸泡12h以上，清洗后得到脱细胞神经基质；

3）用含体积分数10～20%的胎牛血清和1～5μmol／Lβ-巯基乙醇的DMEM-F12培养基预诱导传代后的骨髓间充质干细胞12～24h，无菌冲洗，然后培养基更换为含质量分数1～2%二甲基亚砜和体积分数10～20%的胎牛血清的DMEM-F12培养基，诱导培养12～24h；

4）将脱细胞神经基质用DMEM-F12培养基充分浸润，吸干培养基后37℃孵育，然后接种诱导培养后的神经诱导骨髓间充质干细胞，添加DMEM-F12培养，并补充胎牛血清至体积分数为10～20%，于37℃、5%CO₂、95%湿度的条件下培养48小时，得到复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经。

2.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的外周神经组织是在显微镜下仔细剔除神经外血管、脂肪及结缔组织；然后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶，37℃下、以80～100次/分钟的频率震荡水浴20～30分钟；

倾去胰蛋白酶，PBS清洗终止胰蛋白酶消化，然后去离子水，25℃下、以80～100次/分钟的频率震荡水浴3～4小时；再将低渗处理后的神经组织转入灭菌的PBS溶液中润洗。

3.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的低渗处理后的神经组织是在SB-10溶液、含有Triton X200和SB-16的混合液交替多次循环处理之后，获得脱细胞神经基质。

4.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的低渗处理后的神经组织是在浓度为100～150mmol/L SB-10溶液中，在25℃下、以80～100次/分钟的频率震荡水浴12～15小时，然后转入灭菌PBS溶液中清洗；

清洗后次转入含有质量浓度0.14～0.20%的Triton X200和0.6～0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25℃下、以80～100次/分钟的频率震荡水浴12～24小时，然后转入灭菌PBS溶液中清洗；

清洗后第二次转入浓度为100～150mmol/L SB-10溶液中，在25℃下、以80～100次/分钟的频率震荡水浴5～10小时，然后转入灭菌PBS溶液中清洗；

清洗后第二次转入含有质量浓度0.14～0.20%的Triton X200和0.6～0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25℃下、以80～100次/分钟的频率震荡水浴10～15小时，然后转入灭菌PBS溶液中清洗，获得脱细胞神经基质，4℃保存。

5.如权利要求1所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法，其特征在于，所述的骨髓间充质干细胞的制备及传代培养为：

取骨髓组织，使用含青霉素、链霉素各100U/ml的DMEM-F12培养基，冲洗吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液和Percoll分离液混合后离心，收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬细胞，计数5×10⁵个/ml后即接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂、95%湿度的培养箱中进行原代培养，分别于1、3天半量换液，以后每3天全量换液1次；

待细胞长满瓶底80%时进行传代培养，以1×10⁴个/ml传代。