[发明专利]一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法

权利要求书

1.一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，包括：

引物对

PCR常规试剂：Taq DNA聚合酶、10×buffer PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs；

以及酶切试剂：10×buffer酶切缓冲液、100×BSA和限制性内切酶Nae1。

2.如权利要求1所述常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，所述引物对为：

上游引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

下游引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列。

3.一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，使用权利要求2所述试剂盒用于常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；

步骤二，将所述基因组DNA使用所述试剂盒包含的试剂和所述引物对配制成PCR体系，配制成的PCR体系放入PCR扩增仪中进行PCR扩增，反应完成之后，将PCR产物放入4℃保存备用；

步骤三，用限制性内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；

步骤四，将所述PCR产物和所述酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图进行物种鉴定。

4.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应体系为15μl：即为在200μl PCR反应管中加入0.1μl浓度为2,500units/mL的Taq DNA聚合酶，1.5μl10×buffer PCR缓冲液，1.5μl25mM MgCl₂，1.2μl浓度为10pm/μl的dNTPs，2μl所述基因组DNA，0.5μl浓度为10pm/μl的所述上游引物，0.5μl浓度为10pm/μl的所述下游引物和7.7μl无菌水。

5.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，从预热、退火到延伸共反应35个循环，然后72℃延伸10min。

6.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述酶切反应的反应体系为20μl：即为在200μl PCR反应管中加入1μg所述PCR产物，2μl10×buffer酶切缓冲液，0.2μl100×BSA，0.5μl限制性内切酶Nae1和加无菌水至20μl，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应1h，65℃热失活20min。

7.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述常见鲟鱼种类为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟。

8.如权利要求7所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法可用于区分欧煌与中华鲟、施氏鲟、小体鲟、达氏鳇、西伯利亚鲟、闪光鲟或俄罗斯鲟中任一种。

9.如权利要求8所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶Nae1酶切位点为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、闪光鲟或俄罗斯鲟所述PCR产物中多核苷酸序列5`的350和351个碱基之间的磷酸二酯键，欧煌没有所述酶切位点，中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟所述PCR产物中扩增多核苷酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示序列。