[发明专利]一种DNA病毒基因组的定点改造方法

权利要求书

1. 一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：是通过以下步骤实现的：

步骤一，构建定点切割的核酸酶系统：构建包含导向功能的分子和具有核酸酶活性的蛋白核酸酶系统；

步骤二，将步骤一的定点切割的核酸酶系统转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统的质量之间的比例为1×10⁵:0.25-2μg；

步骤三，将经步骤二处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞完全病变，得到病变细胞；

步骤四，收集步骤三得到的病变细胞和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液；

步骤五，从步骤四得到的子代病毒收获液中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出子代病毒；完成DNA病毒基因组的定点改造方法。

2. 根据权利要求1所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：将上述步骤四得到的子代病毒，通过嗜斑法或有限稀释法之一，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，获得改造后的目的重组病毒。

3. 根据权利要求1或2所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：所述定点切割的核酸酶系统是RNA导向的核酸酶系统、锌指核酸酶系统或者转录激活因子样效应物核酸酶系统之一。

4. 根据权利要求3所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：所述步骤一中构建属于RGN系统的规律性重复短回文序列簇相关系统，即CRISPR/CAS系统，利用AG230质粒进行构建的过程如下：将AG230质粒酶切、纯化后，再利用连接酶连入插入序列，构建得到新质粒，即CRISPR/CAS系统。

5. 根据权利要求4所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：所述插入序列为双链，所述插入序列的个数至少为1个。

6. 根据权利要求1、2、4或5所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：步骤一中构建的核酸酶系统以DNA形式、病毒载体形式、蛋白和RNA复合物形式、编码RNA形式或者非编码RNA形式之一导入。

7. 根据权利要求6所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：步骤二中的转染方法为：将细胞接种于细胞培养板上加入DNA-脂质体复合物进行转染；或者，将细胞和DNA-脂质体复合物混合后，再接种于细胞培养板上进行培养；或者，采用电转方法；或者，采用病毒载体形式、编码RNA和非编码RNA、或者蛋白和RNA复合物之一的形式进行导入。

8. 根据权利要求1、2、4、5或7所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：步骤二中转染12-36h后得到转染细胞。

9. 根据权利要求8所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于：步骤三中的培育时间至少为12h。

10. 根据权利要求1、2、4、5、7或9所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于步骤二中将细胞转染步骤一的核酸酶系统及同源重组供体序列，所述同源重组供体序列通过以下方式进行构建：构建双链DNA序列，其两端与目标序列相同，中间插入需要改造的目的序列。