[发明专利]一种耐热脱氧尿苷焦磷酸酶和编码此酶的多核苷酸

说明书

技术领域

 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐热脱氧尿苷焦磷酸酶，以及编码此酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法和应用。 

背景技术

脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）是一种重要的DNA修饰酶，广泛存在于各种生物有机体中，可特意水解dUTP产生dUMP和ppi，dUMP经甲基化变为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸 (dTTP)，而dTTP又是合成DNA 的主要成分之一。因此，dUTPase在生物体中具有双重基本功能：(1)降低细胞中的dUTP／dTTP比例，防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入，提供DNA复制的稳定性；(2)为DNA的合成提供必需病毒编码的原料dTTP。dUTPase具有种属特异性，且与病毒的毒力和高效复制密切相关。 

英国学者McGeoch在比较了不同来源的脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）的氨基酸序列后发现，来源于不同物种的dUTPase，分子量大小不一，具有 dUTPase的酶活性催化中心。McGeehan根据dUTPase的性质、结构可将其分为三个亚类：I型包括除大多数疱疹病毒外几乎所有来源的dUTPase(包括细菌、真菌、植物和后生动物以及一系列的病毒：痘病毒、逆转录病毒，腺病毒以及无脊椎动物、鱼类和两栖动物的疱疹病毒)；II型则包括哺乳动物和禽类的疱疹病毒所编码的dUTPase。I型和II型虽然都有5个相似的保守motif，特异性底物都为dUTP，但它们在基因长度、motif排列、空间结构上有较大的差别。研究表明，线虫等少数生物上编码的dUTPase在结构上与前两者有很大的不同，没有5个明显的保守motif，而且其水解底物除了dUTP还包括dUDP，暂归属于III型。分析和了解dUTPase的分类及结构特性有助于通过分类及结构特点实现结构蛋白到功能蛋白的研究的深入。 

所有生物都有相当数量的基因编码脱氧尿苷焦磷酸酶，主要是由于此酶是一种重要的DNA修饰酶，降低细胞中的dUTP／dTTP比例，防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入，提供DNA复制的稳定性，因此脱氧尿苷焦磷酸酶具有基础和应用研究价值，目前还没有来源于栖热菌高温噬菌体脱氧尿苷焦磷酸酶的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热脱氧尿苷焦磷酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明的另一个目的是提供一种编码上述脱氧尿苷焦磷酸酶的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

本发明的有益效果： 

脱氧尿苷焦磷酸酶是一种重要的DNA修饰酶，能够降低细胞中的dUTP/dTTP比例，防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入，提高DNA复制的稳定性，因此脱氧尿苷焦磷酸酶可以作为DNA扩增体系的添加物，可以应用于PCR扩增技术中提高DNA扩增的效率和保真度。

本发明提供一种来源于高温菌噬菌体的脱氧尿苷焦磷酸酶，该酶在55-70℃具有催化dUTP水解的活性，能减少体系中dUTP浓度。此外，在目前的PCR反应多在高温下进行，来源于高温菌噬菌体的脱氧尿苷焦磷酸酶在高温下具有较高活性，具有常温脱氧尿苷焦磷酸酶不具备的热稳定性，可以直接添加到PCR体系中，使用便利。 

附图说明

图1是本发明中脱氧尿苷焦磷酸酶基因保守结构域分析示意图； 

图2是本发明中脱氧尿苷焦磷酸酶基因的PCR产物电泳检测示意图，其中M为Marker，泳道1为目的基因产物；

图3是本发明重组质粒RO-dUTP-32a菌落PCR验证电泳示意图，其中M为Marker，泳道1、2、3皆为所挑取单克隆菌落PCR结果；

图4是本发明耐热脱氧尿苷焦磷酸酶基因表达蛋白的SDS-PAGE分析检测电泳图，其分子量为36K道尔顿。其中M为Marker，泳道1是空载pET32a诱导前的蛋白电泳图，泳道2是空载pET32a诱导8小时后的蛋白电泳图，泳道3、4是RO-dUTP-32a诱导前的蛋白电泳图，泳道5是RO-dUTP-32a诱导8小时破碎后沉淀的蛋白电泳图，泳道6是RO-dUTP-32a诱导8小时破碎后上清的蛋白电泳图；