[发明专利]一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及食品及加工原料中小肠结肠炎耶尔森氏菌的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。

背景技术

为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保证食品领域的公共安全，需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中，在我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是小肠结肠炎耶尔森氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7等病原菌。小肠结肠炎耶尔森氏菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性菌，属肠杆菌科耶尔森菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定条件下可引起人和动物致病，引起胃肠道症状外，还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等疾患，甚至可引起败血症，造成死亡。该菌还是重要的食源性致病菌，很多国家都已将该菌列为进出口食品的常规检测项目。

在传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中常规的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期长，同时对于有些细菌仍无法给出快速和准确的鉴定，不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速。

荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。公开号为  的发明专利“一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒”提供了一种利用TaqMan探针法进行小肠结肠炎耶尔森氏菌检测的引物和探针设计方法，“病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增”（公开号：CN101113475）同时设计了可检测霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌和李斯特菌的多条引物用于多重PCR，结果需要经凝胶电泳分析。实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对PCR产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。基因芯片方法在该北苑物的检测中也有运用，公开号为CN102311993 的发明专利“用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒”及公开号为CN102140507的发明专利“用于感染性腹泻的检测型基因芯片及检测用试剂盒”各自提供了用于基因芯片的引物设计和检测方法，但基因芯片的设备依赖性限制了其应用范围，并且往往需要预扩增技术，增加了实验流程。

另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法，其检测对象主要是蛋白质分子，竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子，这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现，是快速检测的常规方法，具有快速、简单、成本低廉的优点，广泛用于食品中毒素、病原微生物以及农药、抗生素残留的筛查。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应，用酶联免疫吸附（ELISA）方法或免疫胶体金胶体金试纸条或完成检测。在免疫胶体金检测中，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成肉眼可见的有色沉淀线，对蛋白的检测依赖高亲和力和高特异性抗体的获得，在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则，DNA较蛋白质更易于产生序列差异，这种差异也更易于准确检出，通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率，通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。