[发明专利]人胚肺成纤维细胞SV-4及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及人胚肺成纤维细胞SV-4及其应用。

背景技术

人二倍体细胞来源于正常的人组织，可以在体外进行有限代次的传代培养并建立稳定的细胞库体系，具有正常的人二倍体染色体数目，无潜在的致肿瘤性。对人用疫苗而言，使用人二倍体细胞为基质，无需考虑外源细胞蛋白和外源DNA残留量的影响。目前国内、外用于疫苗生产的人二倍体细胞主要有WI-38、MRC-5、2BS、KMB-17等。40多年的临床使用经验表明人二倍体细胞作为疫苗生产用细胞基质具备良好的安全性和有效性。

人二倍体细胞液存在某些缺点，影响其在疫苗生产中的广泛应用，例如细胞的繁殖代次有限，培养条件要求较高，培养时间较长，病毒产量较低等，国内外在使用人二倍体细胞过程中存在的主要问题包括：

（一）原始种子匮乏，细胞极限寿命较短，病毒产量低。前述的4种国内外通用人二倍体细胞极限寿命均为50代左右，生产使用代次限定在40代以内。从官方或其他正规渠道获得的原始细胞种子代次接近20代，很难将细胞扩增达到理想的生产规模，同时细胞代次越高培养难度越大，细胞的生长状态越差，这些都会直接影响到病毒的产量，增加生产成本。

（二）细胞的使用权限和范围的限制。可获得的用于生产的上述细胞株数量十分有限，如果用于生产则需要支付高昂的使用许可费，同时限定了生产疫苗的种类，严重阻碍了企业开发和生产更多品种。

由此可见，现有的人二倍体细胞株已经无法满足目前疫苗生产的需求，研制并开发出生物特性良好，病毒适应范围广，生产病毒较容易的人二倍体细胞基质成为疫苗生产领域的迫切需求。

发明内容

本发明的目的是提供人胚肺成纤维细胞SV-4及其应用。

为了实现本发明目的，本发明从具有如图1所示核型的13周龄的女性胚胎中取出一部分人胚肺组织。将该肺组织经过剪碎预处理后用PBS缓冲液（pH值7.2）浸润洗涤，然后用含有胶原酶的组织消化液进行处理直至细胞分离无明显可视组织块，再将细胞悬液进行过滤和离心处理。细胞重悬后至细胞密度5×10⁵个/mL，转移至细胞培养瓶中进行连续培养。通过染色体核型检测，表明该细胞株是正常的人二倍体细胞株，命名为人胚肺成纤维细胞SV-4，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年12月7日，保藏编号CGMCC No.6957。

本发明还提供SV-4的体外培养方法，将SV-4细胞接种于含有5-10%胎牛或小牛血清的MEM、M199、DMEM或BME培养基中，置于35-37℃，5%CO₂条件下培养。

本发明还提供SV-4在病毒培养中的应用，或利用SV-4细胞制备病毒液的方法：SV-4细胞经扩增及传代培养，在传代后的SV-4细胞上接种病毒，培养和收获感染后的SV-4细胞，获得病毒悬液。纯化后的病毒悬液可用于疫苗制备。

前述应用或方法中，所述的病毒为风疹病毒及其它病毒。

前述应用或方法中，先将SV-4细胞培养至细胞汇合度90-100%，按1:2-4的分种比例传代培养，待细胞达到90-100%汇合度时接种病毒。

前述应用或方法中，按0.01-0.1MOI在传代后的SV-4细胞上接种病毒，置于31-38℃，5%CO₂条件下培养。

前述应用或方法中，培养SV-4细胞使用的培养基为含有5-10%胎牛或小牛血清的MEM、M199、DMEM或BME培养基。

本发明提供的人胚肺成纤维二倍体细胞SV-4，在目前检测水平下，未检测到细胞内外源病毒因子污染，为纯净无污染的人二倍体成纤维细胞。

本发明提供的人胚肺成纤维二倍体细胞SV-4在裸鼠动物试验中得以证明该细胞株不具有致肿瘤性。

本发明提供的人胚肺成纤维二倍体细胞株SV-4具有如下生物学特性：

（1）成纤维二倍体细胞特征明显，细胞生长旺盛

如图2A和图2B所示，SV-4细胞在光镜下显示出典型的梭形，呈纤维状极性生长。随着细胞代次的增高，细胞出现个体增大，性状变长，生长速度缓慢，直至停止，证明细胞具有终极寿命特征。如图3A和图3B所示，SV-4细胞在电镜下显示细胞在生长期轮廓完整，细胞核大，细胞内均有十分丰富的内质网、核糖体、线粒体，证明细胞生命状态旺盛。

（2）细胞生命周期长