[发明专利]一种高效重组表达透明质酸酶的方法

权利要求书

1.一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段核苷酸，构建基因工程菌进行表达；所述添加的核苷酸序列为如下（a）或（b）所示的序列：

（a）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，

（b）与（a）中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是在SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因的N端添加一段SEQ ID NO.1所示的核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达。

3.根据权利要求1所述方法获得的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，优选含有重组透明质酸酶基因的pPIC9K。

5.根据权利要求1所述方法获得的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，优选含有重组透明质酸酶基因的毕赤酵母P.pastoris GS115。

7.应用权利要求6所述基因工程菌高效表达透明质酸酶的方法，其特征在于将种子培养液按10%的接种量接种到含25mL BMGY培养基的容量为250mL的摇瓶中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD₆₀₀为4，离心收集菌体接种至诱导表达培养基BMMY，每隔24h补加1%甲醇，诱导表达96h；将发酵液经亲和层析纯化得到透明质酸酶蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，透明质酸酶的纯化条件为：采用葡聚糖镍进行亲和层析纯化透明质酸酶蛋白，分别用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脱杂质，再以500mM的咪唑缓冲液特异性洗脱目标蛋白，再进行梯度透析获得纯透明质酸酶蛋白。