[发明专利]一种褐飞虱不同龄期体内类酵母共生菌检测方法

说明书

技术领域

本发明通过结合变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对褐飞虱不同龄期时多种类酵母共生菌群落结构的变化规律进行研究，属于基因工程技术领域。

背景技术

褐飞虱属于同翅目飞虱科，是危害东南亚国家和我国南方稻区最严重的水稻害虫之一，对农作物的危害除刺吸汁液和产卵危害外，还传播水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病、小麦丛矮病和玉米粗缩病等病毒病，给农业生产造成巨大损失，因此急需一种经济、有效和环保的方式来遏制褐飞虱的发生和危害。

同其他同翅目昆虫一样，褐飞虱体内存在共生菌，类酵母共生菌(Yeast-like Symbiotes，YLS)是飞虱体内的优势菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪体和卵中，并随卵垂直传递给下一代。YLS还参与氮素循环，为寄主提供氨基酸、固醇类物质以及蛋白质等多种营养成分，并对稻飞虱生长、发育、繁殖、致害性变化等起到重要作用。经过高温或抗生素减菌处理后，发现缺共生菌的飞虱若虫的龄期明显比正常若虫长，且存活率也比正常若虫低。随着褐飞虱若虫的生长发育，褐飞虱体内共生菌的数量也随之增加。这些结果表明类酵母共生菌与飞虱的生长发育息息相关，因此明确褐飞虱体内类酵母共生菌具体的变化规律具有十分重要的意义。

然而，褐飞虱体内的类酵母共生菌生存环境较为特殊，因此难以进行离体培养。传统研究主要基于显微法观察褐飞虱不同生长发育期类酵母共生菌的变化，但这种方法效率低且准确性差。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种褐飞虱不同龄期体内类酵母共生菌检测方法。

褐飞虱是一种农业害虫，研究发现其生长发育和体内的类酵母共生菌有密切的联系，明确褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律具有十分重要的意义。尚未见有关利用分子生物学技术分析褐飞虱不同龄期类酵母共生菌的研究报道。

本发明首先收集不同龄期的褐飞虱作为研究对象，利用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)技术和实时荧光定量PCR (Real-time Quantification PCR, qPCR)技术，特定地研究三种类酵母共生菌：Noda菌（Hypomyces chrysospermus），季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)，假丝酵母(Candida quercitrusa)在褐飞虱不同虫龄之间的变化规律。

所述的类酵母共生菌为Noda菌（Hypomyces chrysospermus），季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)，假丝酵母(Candida quercitrusa)。

所述的褐飞虱不同发育时期为1，2龄、3龄、4龄、5龄以及刚羽化雌成虫。

所述的检测不同龄期三种类酵母共生菌的方法过程如下：

1）褐飞虱脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，并提取基因组，以上述提取的基因组为模板；

2）根据三种菌株的18SrDNA的特征序列设计引物进行PCR扩增；

3）利用变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对多种菌株的变化规律定量分析。

利用DGGE和qPCR结合技术揭示了三种菌在褐飞虱不同龄期呈现相近的变化规律。在4龄若虫期之前，不同共生菌的数量均随着虫龄的增加而增加，5龄若虫期数量有显著的下降趋势，而到成虫期数量又有显著地回升。其中Hypomyces chrysospermus菌的数量在这三种共生菌中占有绝对优势。

本发明的有益效果：

本发明利用DGGE和qPCR技术检测了褐飞虱不同龄期多种类酵母共生菌的变化规律，为今后研究类酵母共生菌与褐飞虱生长发育之间的联系提供了有效的工具。

附图说明

图1 是三种菌在不同龄期的变性梯度凝胶电泳图；A: Hypomyces chrysospermus，B: Pichia guilliermondii，C: Candida quercitrusa。

图2A是Hypomyces chrysospermus质粒标准品的标准曲线图。

图2B是Pichia guilliermondii质粒标准品的标准曲线图。

图2C是Candida quercitrusa质粒标准品的标准曲线图。