[发明专利]不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明通过结合变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律进行研究，属于基因工程技术领域。

背景技术

褐飞虱是我国及东南亚水稻上最主要的害虫之一，该虫为单食性害虫，不仅通过产卵或者刺吸水稻韧皮部汁液造成直接伤害，而且通过传播病毒病造成间接伤害，培育和推广抗性品种是遏制褐飞虱肆意繁殖和危害的优先策略；但是长期种植抗性水稻品种导致飞虱产生新的致害性，而把已经产生新致害性的飞虱转移到其他品种的水稻上强迫饲养数代后，飞虱的致害性即发生变化。

有研究推测褐飞虱致害性的转变可能与飞虱体内的共生菌有关，褐飞虱体内存在着类酵母共生菌(Yeast-like Symbiotes，YLS)，是飞虱体内的优势菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪体和卵中，并随卵传递给下一代。YLS还参与氮素循环，为寄主提供氨基酸、固醇类物质以及蛋白质等多种营养成分，并对稻飞虱生长、发育、繁殖、致害性变化等方面起到重要作用。

研究发现，取食抗性水稻品种后飞虱体内共生菌的数量急剧下降，特别是在适应抗性品种过程中的第二代，是此过程的关键世代，体内共生菌的数量达到最低，到第三代时，共生菌的数量开始回升。在正常情况下，取食感虫品种TN1的生物型1雌成虫的体重、生长速度和产卵量均显著高于取食抗性水稻品种的雌成虫。因此明确褐飞虱在适应抗性品种过程中其体内共生菌的变化规律对飞虱致害性的变异至关重要。

然而，褐飞虱体内的类酵母共生菌由于生存环境较为特殊，难以进行体外培养。传统研究褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律的手段主要是基于显微观察法，但这种方法效率低且准确性差。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种不同抗性水稻上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法。

褐飞虱是一种重要的农业害虫。研究发现褐飞虱对不同品种抗性水稻的适应性与其体内的类酵母共生菌有密切的联系，明确褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律对飞虱的防治起了至关重要的作用。尚未见有关利用分子生物学技术分析不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌变化的研究报道。

一种不同抗性水稻品种上褐飞虱体内类酵母共生菌的检测方法，选取不同抗性水稻品种上的最初8个世代的褐飞虱，针对多种类酵母共生菌，结合变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）与荧光定量PCR(Real-time Quantification PCR, qPCR)技术进行定量检测。

所述的水稻品种中，抗性水稻品种为ASD7(bph2)、RH(Bph3)、Mudgo(Bph1)，感虫水稻品种为TN1。

所述的类酵母共生菌为Noda菌(Hypomyces chrysospermus)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、假丝酵母(Candida quercitrusa)。

所述的方法，过程如下：

1）分别取三种抗性水稻品种及一种感虫水稻品种上的最初8个世代刚羽化的褐飞虱，对所述的褐飞虱的脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，提取基因组；

2）根据多种菌株的18SrDNA的特征序列设计引物，以上述提取的基因组为模板进行PCR扩增；

3）利用变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对多种菌株的变化规律定量分析。

利用结合DGGE和qPCR技术明确了三种类酵母共生菌在褐飞虱适应抗性品种上最初8代的变化规律：在适应的过程中三种共生菌的数量急剧下降，在第二代时三种共生菌的数量均达到最低，到第三代时，共生菌的数量开始回升，之后共生菌的数量趋于平缓。三种共生菌的数量在同一世代不同抗性水稻上的变化不尽相同，Pichia guilliermondii和Candida quercitrusa在同一世代不同抗性水稻之间的差异不显著，但是Hypomyces chrysospermus在三种抗性水稻上的差异显著，特别是在抗性水稻品种Mudgo上，与其他两种抗性水稻品种相比差异显著。另外对三种菌在三种抗性水稻品种的原始拷贝数分析，发现Hypomyces chrysospermus在三种共生菌中数量最多，其次是Pichia guilliermondii，最后是Candida quercitrusa。

本发明的有益效果：