[发明专利]乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类遗传育种技术领域，具体涉及乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法。

背景技术

鱼类具有两性生殖、雌核发育、杂种生殖等多种方式繁衍后代，延续种群。雌核发育(gynogenesis)是指卵子必须经精子激发才能产生只具有母系遗传物质的个体的有性生殖方式。营天然雌核发育的鱼类共同的特点是：成熟卵子的染色体数不发生减半，仍与体细胞的染色体数相同。当两性亲缘种的精子进入卵子后，仅起激活作用，精核一般呈致密状态，不发生原核化，不与雌性原核融合，所产生的子代与母本相似，基因型与母本相同或不尽相同，最终形成单性的雌性群体。

自Opperman et al证明鱼类雌核发育可以人工诱导以来，人工雌核发育的研究就十分活跃，广泛应用于家系纯化、遗传改良、性别分化和生殖控制等研究领域，特别是在性别控制和快速建立纯系方面有独特的应用。已经报道的人工雌核发育获得存活后代的鱼类有30多种，包括鲟鱼、虹鳟、鲤、鲫、草鱼、鳜鱼、罗非鱼等。但不同的鱼类因生活习性差异、生殖条件不同，一种鱼的雌核发育技术不能直接应用于另一种鱼类。针对每一种鱼都需要开发相应的雌核发育人工诱导技术与条件。人工诱导雌核发育通过使精子染色体遗传失活，这种不具有遗传信息的精子入卵后，卵子开始发育；再对卵子染色体进行加倍即可发育成正常幼鱼。

乌苏里拟鲿属鲶形目(silurformes)鲿科(Bagridae)拟鲿属（Pseudobgrus)，它是鲿科鱼类中生长速度最快的种类,最大个体长度可达1m，雌雄异体、异型，雄性个体显著大于雌性个体，成鱼体重雄性几乎为雌性的2倍甚至更多。其脂肪含量高,肉质细嫩,肉味鲜美,具有很高的食用价值和经济价值。如果能够进行单性全雄鱼养殖，将极大地提高产量及经济效益。按照雄鱼性逆转→人工雌核发育→超雄鱼→全雄鱼的技术路线，人工诱导雌核发育将成为决定成败的重要一环。但国内外至今未见这种鱼的雌核发育报道。

发明内容

    本发明要解决的技术问题是提供乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法，快速建立纯系，实现乌苏里拟鲿全雄性单性育种，提高产量，给养殖户带来丰厚的回报。

本发明通过以下技术方案实现：乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法，步骤包括：

（1）精子的遗传失活：取乌苏里拟鲿性成熟雄鱼的精液，所述精液与精子保存液按体积比1：5进行稀释，纱绢过滤后以1.0～1.8mm厚度均匀铺设到于培养皿中，将培养皿置于暗箱中用波长2537A的紫外灯照射10～25min，照度为66μW/cm²，照射距离为 10～25cm，摇床转速为30～50R/min；

精子保存液：每500ml溶液中含NaCl 2.5～4.0g， KCl 1.0～1.6g， CaCl₂ 0.1～0.2g， MgSO₄.7H₂O 0.1～0.2g，NaHCO₃ 0.2～0.4g，防腐剂 0.1～0.3g；

（2）受精卵冷休克处理：取乌苏里拟鲿性成熟雌鱼的卵子与步骤（1）中遗传失活后的精子进行人工授精，卵子受精后5～10 min，转移到0～4℃的冷水中10～40min，使受精卵染色体二倍化；

（3）孵化：将冷休克处理后的受精卵置于常温下的孵化装置中孵化，保持水有一定的流动性，水中含氧量充足，培育鱼苗。

不同的鱼类因生活习性差异、生殖条件不同，一种鱼的雌核发育技术不能直接应用于另一种鱼类。针对每一种鱼都需要开发相应的雌核发育人工诱导技术与条件。本发明的主要技术创造之处在于：通过调整紫外线的照射距离和照射时间，寻找出灭活乌苏里拟鲿精子的最佳时间；在授精后不同的时间起点进行不同时间长度的冷休克，确定具有最高存活率的处理时间，作为冷休克的合适时间长度。从而筛选出适合于乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育的最适条件，为超雄鱼的培育奠定基础。

乌苏里拟鲿性成熟雄鱼的精液与精子保存液按体积比1：5进行稀释：使得精子在离体后可以保持较长的存活时间，在随后的处理中活性受到抑制又不会死亡；同时便于后续遗传物质灭活时精子处于一种好的流动性，防止照射不均匀。

精子的遗传失活采用紫外线照射，避免使用化学物质对精子产生毒害作用；精子在遗传物质灭活后仍具有刺激卵细胞发育的能力；照射设备简单易行。