[发明专利]miRNA-19a作为哺乳动物宿主细胞增殖调控靶标的应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，涉及一种miRNA作为遗传重构的靶标在哺乳动物宿主细胞重构改良中的应用。

背景技术

用哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白类药物的重要性日益突出。为了满足新产品的研发和巨大的生产需求，对中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）等生产用的宿主细胞进行各种策略的遗传工程改造，克服其不适应工业化生产的诸多缺点，是实现哺乳动物宿主细胞生产重组蛋白类药物的基础，而发现可用于细胞工程化改造的靶点是关键。

以哺乳动物细胞为宿主生产蛋白质药物，具有细菌、酵母等宿主细胞所不具备的优势。与低等微生物宿主细胞相比，哺乳动物细胞表达系统可以提供准确的转录后修饰功能，包括蛋白折叠、二硫键形成、亚基多聚化、蛋白磷酸化以及糖基化等，因而表达的重组蛋白在结构和功能方面更接近天然的蛋白质。由于这些优点，目前已经上市或正在进行临床研究的基因工程药物中，大约70%由哺乳动物细胞生产。在各种哺乳动物细胞表达系统中，CHO细胞是生产抗体或糖蛋白的首选宿主细胞。但CHO细胞同其它哺乳动物细胞一样，存在一些不适合工业化大规模培养的缺点，如增殖率低、对培养环境的要求高、对各种应激环境的耐受能力差，各种不利的环境因素如营养缺乏、有害代谢产物积累、溶氧过高或过低、机械搅拌等均可影响细胞增殖，甚至引起细胞凋亡，尤其在无血清培养基中，细胞更容易生长缓慢并发生凋亡。另一方面的问题则是哺乳动物细胞生长不易控制。如果细胞持续不断的保持高生长速率，很快会达到生物反应器的容量上限，由于体外培养的细胞接触抑制机制较弱，过于拥挤的细胞将导致密度依赖性的细胞凋亡，而一旦细胞凋亡启动，死亡细胞的内容物释放到培养基中，会进一步引起其它细胞的死亡，进而使生产过程提前终止。为了解决上述问题，优化培养条件是一条重要途径，如优化反应器设计和控制，使之更准确的控制温度、溶氧、pH等参数；优化搅拌方式，降低对细胞的机械损伤；优化培养基设计，在培养基中添加抗凋亡抑制剂，补充各种营养成份和生长因子，使细胞在无血清和无蛋白培养基中高活力生长等。另一条可行的途径是对细胞自身进行遗传改造，培育更能适应工业化生产的工程细胞株。目前的主要手段是从参与代谢过程的生长因子、酶等蛋白的基因入手，通过改变这些重要蛋白（或肽）的表达水平，使细胞具有更适合大规模培养的特性。例如，通过基因重组将转铁蛋白和胰岛素生长因子基因转染到CHO细胞中，使之获得在无血清培养基中的生长能力；通过遗传改造调控Bcl-2凋亡蛋白家族成员或Bcl-X抗凋亡家族成员的表达，提高细胞的抗凋亡能力等。

MicroRNA（miRNA）是一种內源性的具有调控功能的单链非编码RNA，一般长18-22nt，在生物体中广泛存在，并发挥着重要的生物学调控作用。miRNA主要通过种子序列（Seed sequence）与靶基因mRNA的3’-UTR区结合，改变mRNA的稳定性和翻译效率。miRNA的产生不经过蛋白质翻译过程，具有多靶点性，并且对不同的靶mRNA抑制程度不同，因此是一种非常灵活高效的基因表达转录后调控方式，在生物响应环境应激、适应环境变化的过程中发挥了重要作用。将miRNA作为哺乳动物宿主细胞遗传重构靶点具有诸多优势，miRNA是较小的RNA分子，在功能获得和缺失性表达中都不会占用细胞的蛋白质翻译资源，这对于重组蛋白生产非常有利；miRNA能对多个靶点进行不同程度的调控，而这些靶基因往往存在于相关联的信号网络中，因此可能比以往对个别功能蛋白进行改造具有更大的优势，对细胞表型产生更为深刻的影响；另外，miRNA对靶蛋白的表达不是完全抑制，比基因敲除等方法对细胞的毒性作用可能更小。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miRNA作为哺乳动物宿主细胞增殖调控靶标的应用，采用基因工程技术改变该miRNA在哺乳动物宿主细胞中的表达量，间接调控与细胞增殖相关蛋白的表达量，进而影响细胞的增殖能力，达到调控哺乳动物宿主细胞增殖的目的。

为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1．miRNA-19a作为哺乳动物宿主细胞增殖调控靶标的应用。

进一步，所述哺乳动物宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞，所述miRNA-19a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2．调控哺乳动物宿主细胞增殖的方法，通过抑制miRNA-19a的表达来促进哺乳动物宿主细胞的增殖，通过促进miRNA-19a的表达来抑制哺乳动物宿主细胞的增殖。