[发明专利]用于大豆根腐病病原真菌多样性分析的特异性引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于病原真菌多样性分析的特异性引物。

背景技术

大豆根腐病是一种分布广、危害重、防治困难的世界性病害。其初期主要侵染大豆皮层，最终危害侧根，严重影响作物对水分和养分的吸收。大豆根腐病病原菌构成复杂，我国东北地区主要以尖镰孢菌（Fusarium Oxysporum）、腐皮镰孢菌（Fusarium Solani）、禾谷镰孢菌（Fusarium Graminearum）、燕麦镰孢菌（Fusarium Avenaceum）和半裸镰孢菌（Fusarium Semitectum）为主。虽然现在可以利用分子标记技术将每种大豆根腐病病原菌都单独鉴定出来，但是大豆土壤中往往包括多种根腐病病原菌，如果要进行防治就必须要先进行多样性分析，从而知道大豆土壤中含有几种不同的大豆根腐病病原真菌，分别是哪些大豆根腐病病原真菌。目前尚无可供大豆根腐病病原真菌多样性分析的特异性引物，因此给大豆根腐病病原真菌的检测和防治带来了困难。

发明内容

本发明提供了一种用于大豆根腐病病原真菌多样性分析的特异性引物，本发明特异性引物与DGGE技术联用，可以仅通过二个步骤检测出我国东北地区被测大豆土壤中包含几种大豆根腐病病原真菌，分别属于什么菌种。

本发明用于大豆根腐病病原真菌多样性分析的特异性引物的核苷酸序列为5′-CGTTGGGTTATTCCCCGGC-3′。

本发明用于大豆根腐病病原真菌多样性分析的特异性引物以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae）为模式生物，选用S.cerevisiae18s rRNA（S.cerevisiae18s rRNA NCBI登录号J01353）为模板，根据S.cerevisiae18s rRNA第359bp～377bp设计引物本发明特异性引物，并对位于第376bp和377bp位置的碱基进行修改。

本发明特异性引物可以用于尖镰孢菌（F.Oxysporum）、腐皮镰孢菌（F.Solani）、禾谷镰孢菌（F.Graminearum）、燕麦镰孢菌（F.Avenaceum）、半裸镰孢菌（F.Semitectum）、轮枝镰孢菌（F.verticillioides）、茄腐皮镰孢霉(F.solani)、蓝色镰孢菌（F.coeruleum）、木贼镰孢菌（F.equiseti）、大豆疫霉菌（Phytophthora spp.）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）在内的多种大豆根腐病病原真菌的多样性分析和检测。

本发明特异性引物的使用效果具有多样性分析准确，检测结果直观、快速、可靠等优点。

附图说明

图1是具体实施方式二验证试验中以特异性引物F.rr和通用引物NS1为引物对12组样品进行PCR的凝胶电泳图，图1中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为尖镰孢菌（F.Oxysporum）DNA，“2”泳道标样为腐皮镰孢菌（F.Solani）DNA，“3”泳道标样为禾谷镰孢菌（F.Graminearum）DNA，“4”泳道标样为燕麦镰孢菌（F.Avenaceum）DNA，“5”泳道标样为半裸镰孢菌（F.Semitectum）DNA，“6”泳道标样为轮枝镰孢菌（F.verticillioides）DNA，“7”泳道标样为茄腐皮镰孢霉(F.solani)DNA，“8”泳道标样为蓝色镰孢菌（F.coeruleum）DNA，“9”泳道标样为木贼镰孢菌（F.equiseti）DNA，“10”泳道标样为大豆疫霉菌（Phytophthora spp.）DNA，“11”泳道标样为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）DNA，“12”泳道标样为上述1～11号泳道混合DNA。

图2是具体实施方式二验证试验中以引物YUAN1和通用引物NS1为引物对12组样品进行PCR的凝胶电泳图，图2中“M”泳道标样为Marker，1～12号泳道中的标样与图1一致。

图3是具体实施方式二干扰试验中以特异性引物F.rr和通用引物NS1为引物对链格孢菌（Alternaria）进行PCR的凝胶电泳图，图3中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为链格孢菌（Alternaria）DNA。

图4是以5′端添加“GC-clamp”的特异性引物F.rr进行DGGE的凝胶电泳图，图4中“A1”泳道标样为具体实施方式二验证试验中引物F.rr和NS1扩增第1泳道的PCR产物，图4中“A2”泳道标样为具体实施方式二验证试验中引物F.rr和NS1扩增第12泳道的PCR产物。