[发明专利]一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种瑞鲍迪甙M的制备方法，特别涉及一种瑞鲍迪甙M的生物制备方法。

背景技术

甜味剂是一类广泛应用于食品、饮料及糖果生产的食品添加剂。其既可以在食品的生产过程中添加，也可以在家庭烘焙时经过适当稀释作为蔗糖的替代品使用。甜味剂包括天然甜味剂和人工甜味剂，前者如蔗糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等，后者如阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一类从植物甜菊中提取出来的天然甜味剂，目前已被广泛用在食品及饮料中。甜菊的提取物中含有包含瑞鲍迪甙在内的多种甜菊糖，天然提取的甜菊糖不同的批次成分差异较大，需要后续的提纯。目前商业化的产品瑞鲍迪甙A包含一些其它的甜菊糖如瑞鲍迪甙C，D及F等。提取的方法制备的甜菊糖通常还有混有一些杂质，有可能对其使用范围造成一定的影响。瑞鲍迪甙M相较于瑞鲍迪甙A具有优势，但其在甜菊叶中的含量极少，且只在甜菊Morita植株中被检测到（2010，J.Appl.Glycosci.,57,199-209）。目前尚未有瑞鲍迪甙M的商业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法可以较低的成本，较短的周期生产出高纯度的瑞鲍迪甙M产品。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法以瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶和/或含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙M。

根据本发明，所述葡萄糖基供体可以为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系（2007，FEBS Letters，581，2562–2566）。其中，优选由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系，UDP葡萄糖价格较高，采用由UDP-葡萄糖再生体系可以大幅度降低成本。

根据本发明，UDP-葡萄糖基转移酶（即脲苷二磷酸葡萄糖基转移酶，简称UGT）是已知的。优选地，本发明所用的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊（Stevia rebaudiana）的UGT-A和/或来自水稻（Oryza sativa）的UGT-B。

UGT-A的氨基酸序列可以与序列2具有至少60%的一致性。优选地，UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少70%的一致性。进一步优选地，UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性。最优选地，UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少90%的一致性。根据一个具体方面，UGT-A的氨基酸序列与序列2完全一致。

UGT-B的氨基酸序列可以与序列4具有至少60%的一致性。更优选地，UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少70%的一致性。进一步优选地，UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少80%的一致性。最优选地，UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少90%的一致性。根据一个具体方面，UGT-B的氨基酸序列与序列4完全一致。

根据本发明，可以使所述反应在温度4℃～50℃以及pH5.0～9.0的水相体系中进行。优选地，使所述反应在温度25℃～35℃以及pH6.5～7.5的水相体系中进行。

更优选地，使反应在温度30℃下进行。

更优选地，使反应在pH7.0下进行。

根据一个具体优选方面，使反应在pH7.0的磷酸缓冲液中进行。

根据本发明，当采用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞来进行所述催化时，可以使所述反应在细胞通透剂存在下进行。优选的，所述细胞通透剂为甲苯，其在整个反应体系中的体积比浓度可以为1%～3%。更优选地，甲苯的体积比浓度为2%。

根据本发明，所述的重组细胞可以且优选为微生物细胞，其中微生物可以且优选为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母等。

根据一个具体和优选方面，所述方法实施如下：将反应所用的全部原料加入到反应釜中，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应。反应完毕后，通过提纯处理即可获得达到使用要求的瑞鲍迪甙M产品。一个具体的提纯方方法是经包括树脂分离在内的后处理，按照该提纯方法，可获得纯度高达95%的瑞鲍迪甙M产品。