[发明专利]一种单核细胞增生李斯特菌LAMP可视化检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食源性病原菌检测技术领域。具体涉及一种基于单核细胞增生李斯特菌靶基因prfA的LAMP可视化检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是Murray等在1924年首次从患有单核白细胞增多和败血症的兔子体内分离到，并于1940年由Pirie命名为Listeria monocytogenes。1986年，LM被认定为一种重要的食源性致病菌，能引起人的严重胃肠炎、脑膜炎、孕妇流产和全身性感染，可导致死亡。最常见于老人、孕妇或免疫缺陷的人群。美国CDC公布2011年夏秋季科罗拉多州Jensen农场甜瓜污染引起李斯特菌病的流行，其中146个病例中30例死亡，死亡率高达20.5％。

环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本Notomi等开发的新的恒温核酸扩增方法，该方法能在水浴锅等简单设备提供的60-65℃恒温条件下通过成环产物介导来高效率扩增基因，通过电泳或目视颜色变化判定检测结果。该方法操作简单，特异性强，灵敏度高，目前已经成为检测食源性病原的新型检测方法之一。

常规传统的细菌培养分离检测依赖于实验室，结果可信，一直作为检测LM的“金标准”，但其耗时长，不利于紧急事件发生时病原的快速筛查，而免疫学方法如ELISA法等和分子检测方法如PCR法等需要较昂贵的仪器设备和技术支撑。LAMP反应仅需水浴锅或温箱提供60-65℃的恒温条件即可进行，操作简单，适用于实验条件相对薄弱的基层地区开展食源性致病菌的快速检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、特异而又简单实用的单核细胞增生李斯特菌的的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。本发明为实验条件相对薄弱的基层地区利用LAMP方法检测单核细胞增生李斯特菌提供了新的解决方案。

本发明的具体方案包括下列步骤：

（1）引物设计：根据Genbank公布的LM L312（serotype4b）菌株（登录号：FR733642.2）、LM EGDe（登录号：NC_003210.1）菌株、LM NVH295菌株（JF431463.1）等的靶基因prfA基因序列设计特异性引物组合，所述引物组合的DNA序列如下所示：

外引物prfA-B3：5′-AAGCTTCCCGTTAATCGA-3′（序列见SEQ ID NO：1）；

外引物prfA-F3：5′-GGCTTTCGTTATAATGTCTGG-3′（序列见SEQ ID NO：2）；

内引物prfA-BIP：

5′-AACTACTGAGCAAAAATCTTACGCAGCTAGACTGTATGAAACTTGTT-3′（序列见SEQ ID NO：3）；

内引物prfA-FIP：5′-TAGCCTGCTCGCTAATGACTTTATTGATACAGAAACATCGGTT-3′（序列见SEQ ID NO：4）。

（2）样品中细菌基因组的提取：按照中华人民共和国国家标准GB4789.30-2010《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》中指定的方法对待检样品进行增菌培养12～24h；采用细菌基因组提取试剂盒（离心柱型，购自TIANGEN公司，产品目录号：DP302）或者常规热煮沸法提取细菌基因组。其中热煮沸法步骤为：取待检样品增菌培养液1mL，10000r/min离心5min，弃上清。用100μL灭菌水重悬菌体沉淀，沸水浴10min，冰上放置5min，12000r/min离心5min，取上清即为基因组DNA，-20℃短期保存备用。

（3）环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法：