[发明专利]一种快速大量获得家蚕微孢子虫孢壳的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及家蚕微孢子虫诊断鉴定技术领域。

背景技术

微孢子虫是一类以孢子形式进行细胞内专性寄生的病原体，寄主广泛，几乎所有的动物，包括原生动物和人类都可以感染微孢子虫。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是于1857年在病蚕中分离鉴定到的，它能够感染家蚕，引发家蚕微粒子病，是蚕业生产上的毁灭性病害，因此家蚕微孢子虫的检测在蚕业上至关重要，近年来，针对微孢子虫种间孢壁蛋白抗原性的不同，逐步发展起了一些免疫学检测方法。免疫学检测方法是通过抗原抗体反应呈现某种反应现象，因此特异性好、效价高且针对表面蛋白的单克隆抗体，对于微孢子虫的诊断是宝贵的工具，为了获得位于微孢子虫表面的抗原蛋白制备有价值的单克隆抗体，得到纯化的孢壳必不可少。

2008年吴正理等建立了发芽结合密度梯度离心（Germination&Density Gradient Centrifugation，GDGC）法即发芽法纯化家蚕微孢子虫孢壳，再对孢壳进行蛋白提取。但是，发芽法，一方面，发芽过程需要孢子活力较高，才能保证发芽率，纯化后才能得到足够的孢壳，但是在孢子储存过程中，孢子的活力急剧下降，造成孢子发芽率很低，仅为大约为10-20%，甚至不发芽从而得不到孢壳，并且经一次发芽处理以后的孢子无法再发芽，因此发芽法在操作中存在极大的不可重复性，造成时间、成本的浪费；另一方面，由于发芽法纯化家蚕微孢子虫的孢壳需要使用碱性条件将孢子进行体外发芽，碱性条件下位于孢壳上的部分碱溶性蛋白损失，造成蛋白质信息缺失。发芽法中孢子发芽需要28℃水浴，并且对孢子的活力要求较高，只有新鲜孢子才能保证发芽，一旦病蚕组织材料或纯化的孢子在4℃冷藏一段时间后，孢子的发芽率就会很低，而且孢子与发芽液有一定的比例关系，若孢子过多则发芽会受到抑制，并且发芽过程需隔段时间人工混匀，操作繁复。

发明内容

本发明提供了一种快速、大量提取家蚕微孢子虫孢壳的方法，提取的孢壳完整，蛋白完整。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种提取家蚕微孢子虫孢壳的方法，包括以下步骤：将10⁹～10²⁰个/400μL的家蚕微孢子，以1μL：1mg的家蚕微孢子悬液与212～300μm的玻璃珠混合，置于微量管混匀器震荡8～12小时，取孢子悬液进行梯度密度离心，取沉淀。本方法孢壳得率高；玻璃珠使孢壳产生小切口，内容物流出，孢壳形态、结构完整；孢壳所含蛋白未丢失，保证蛋白信息完整。

上述梯度密度离心是指Percoll梯度密度离心，设置不同浓度的Percoll溶液，分别为1.5mL30%、2mL45%、2mL60%、2mL75%、1.5mL90%，在梯度Percoll溶液上端加入破碎的孢子悬液，使用超速冷冻离心机4℃，30000g离心40min，收集60%Percoll溶液层的沉淀。家蚕微孢子虫孢子的密度为1.30～1.35g/cm³，孢壳密度约为1.113g/cm³，可有效的将孢壳分离。

上述家蚕微孢子的制备方法包括以下步骤：取家蚕3龄起蚕添食家蚕微孢子虫，于5龄后期收集组织（包括丝腺，中肠和蚕表皮），加0.09g/L NaCl溶液匀浆研磨，将匀浆液用4层纱布过滤，滤液经差速离心粗提后，将粗提孢子加脱脂棉过滤，再进行Percoll梯度密度离心，设置不同浓度的Percoll溶液，分别为30%（1.5mL）、45%（2mL）、60%（2mL）、75%（2mL）、90%（1.5mL），在梯度Percoll溶液上端加入约孢子粗提液，使用超速冷冻离心机4℃，30000g离心40min，收集底层沉淀即为纯化的孢子，4℃保存。

上述提取家蚕微孢子虫孢壳的方法，包括以下步骤：取纯化的孢子加入PBS溶液悬浮，再加入212～300μm玻璃珠混匀，家蚕微孢子悬液与玻璃珠用量为1μL：1mg，置于微量管混匀器上4℃振荡破碎8～12小时；静置，玻璃珠自然沉降，取出破碎的孢子悬液，进行Percoll梯度密度离心，Percoll溶液梯度为1.5mL30%、2mL45%、2mL60%、2mL75%、1.5mL90%，在梯度Percoll溶液上端加入破碎的孢子悬液，使用超速冷冻离心机4℃，30000g离心40min，收集60%Percoll溶液层的孢壳，经2次Percoll密度梯度离心，收集纯化的孢壳，洗涤后分装于-80℃冰箱保存备用。

有益效果