[发明专利]一种透明质酸的生产方法

说明书

技术领域

本发明特别提供一种高产率的透明质酸的生产方法。 

背景技术

透明质酸即玻璃酸（Sodium Hyaluronate）、玻尿酸，简称HA，是一种酸性粘多糖。其分子结构是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3糖苷键反复交替连接而成，分子量在1O万至400百万之间。分子中两种单糖即β-D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)和N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺(N—acetyl glucosamine)按1：1的摩尔比组成。 

分子式：（C₁₄H₂₀NNaO₁₁）n，CAS号：9004-61-9，其双糖结构如下： 

HA的分子结构

1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质，1937年，Kendall等就发现链球菌可产生HA，工业化生产水平的HA发酵是日本资生堂开始研究的，80年代开发成功，并首先应用在化妆品中。我国从80年代开始研究HA的分离纯化制备工艺和临床应用，90年代初已有HA制剂作为新药上市。不同动物组织和细菌来源的HA无种属差异，对人类及动物无抗原性，生产方法中的提取法正逐渐被微生物发酵法替代。 

1937年，Kendall等发现溶血性链球菌streptococcushaemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜；其后，又陆续报道了能合成HA的微生物菌种。由于许多链球菌都可以合成以HA多糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌（特别是对人体危害较小的C型）成为研究最多的HA生产菌，已报道的能作为HA生产菌的链球菌有：溶血性链球菌(A型)，兽疫链球菌（C型），马链球菌（C型），粪马链球菌（C型），缺乳链球菌（C型）以及鸡霍乱杆菌(C型)等；其中A型为人体致病菌，C型则只能感染畜类。1983年，首次报道了日本的资生堂用链球菌生产HA，随后，英美等国相继报道了采用微生物发酵法生产HA的方法，大大拓宽了HA的来源，推动了HA的研究和应用。微生物发酵生产HA的实现是HA生产领域在近年来取得的最重大的进展。 

HA在细菌内的生物合成路线表明，透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖在透明质酸合成酶作用下通过β-l-3和β-l-4糖苷键连接而成的二糖单体重复构建而形成的直链高分子多糖。在有氧条件下，链球菌利用氧分子将NADH氧化为NAD，同时ADP转化为ATP。ATP的积累有利于UTP的生成，而UTP是合成HA的两个前体化合物（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖）所必须的物质，因而从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。但是，细胞在合成HA的同时也合成大量的小分子有机酸，其中大部分是乳酸和乙酸，使得发酵过程中pH值以0.01-0.15/min的速度降低。一方面大量的碳源流向乳酸合成，使得碳源向透明质酸的转化率很低；另一方面当发酵液pH值低于5.0时，菌体生长和代谢很慢或停止，限制了发酵生产中HA的产率（高海军，Streptococcus zooepidemicus。生物合成透明质酸的过程优化与代谢网络分析，无锡轻工业大学，1999），这也成为了限制透明质酸发酵工业的一 个重要因素。 

微生物产生大量乳酸的原因是为了获得大量NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的再生，当溶氧充足时，乳酸的产量很低，原因是氧可以直接氧化NADH为NAD（Chong B.f.,Nielsen L.K.Amplifying the cellular reduction potential of Streptococcus zooepidemicus.J.Biotech.2003,100:33-41）。但是由于透明质酸发酵液十分粘稠，导致溶氧很低，因此乳酸的产量较大。 

针对以上情况，要提高透明质酸的产率，必须寻找途径减少乳酸的产生。 

中国专利CN200410070767.8提供了一种方法：构建一个含有phbCAB基因序列的质粒表达载体，再导入链球菌中进行表达聚羟基丁酸（PHB），能够有效减少乳酸产生、提高透明质酸产量。PHB的合成可以将大量的NADH氧化成NAD，从而避免了NADH的积累刺激乳酸的产生，同时NAD也是合成透明质酸所需的，因而透明质酸产量提高29％，但是最终产率也只有0.45g/L。 

至今尚没有使用兽疫链球菌（HA-116ATCC39920）发酵生产透明质酸时向培养基中添加β-羟基丁酸钠和烟酸的报道。 

发明内容