[发明专利]一种ENU诱导草鱼基因组DNA中基因突变的化学方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种ENU诱导基因突变的化学方法。

【背景技术】

养殖鱼类繁殖力强、体外受精和体外孵化等特点都十分有利于实施基因组化学诱变。ENU（N-ethyl-N-nitrosourea, N-乙基-N-亚硝基脲）是一种化学诱变剂，它通过对基因组DNA碱基的烷基化修饰，诱导DNA 在复制时发生错配而产生突变。它主要诱发单碱基突变，从而使得相应基因发生突变，其诱变模式与自发基因突变特征类似。同时，ENU的突变效率非常高，单个位点的突变率可达0.5 × 10^-3到3.9 × 10^-3，是其他突变手段的10倍左右，而且这种突变是随机的，不具有任何的倾向性。目前，ENU诱变已在果蝇、斑马鱼、青鳉、非洲爪蟾和小鼠等模式生物中成功开展，获得了一些列功能突变体，成为解释模式生物功能基因组的重要方法和手段。尽管，化学诱变技术已广泛用于微生物和作物的遗传育种，但国内外在养殖鱼类中开展的极其有限。 ENU诱变应该也可在养殖鱼类中进行DNA诱变，筛选获得优良突变性状，在养殖鱼类遗传改良方面具有潜在的发展前景。

草鱼为典型的草食性鱼类，是我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，其性成熟时间通常需要5年以上，体重在大于10Kg，通常六代选育需要耗费30年以上的时间，迄今为止，草鱼没有获得选育良种。中国专利文献关于化学法诱导草鱼类基因突变的专利目前还未见报道。 

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种ENU诱导草鱼基因组DNA中基因突变的化学方法。

本发明的再一的目的是，提供一种ENU工作液的新用途。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 

一种在草鱼基因组DNA中利用ENU 作为诱导剂诱发基因突变的化学方法， ENU 作为诱导剂诱变草鱼胚胎处理浓度为0.1~0.5 mM；精子诱导处理浓度为0.5~10 mM。

所述的ENU 作为诱导剂诱变草鱼胚胎处理最佳浓度为0.3mM。 

所述的ENU 作为诱导剂诱变精子处理最佳浓度为1mM。 

本发明诱导方法中使用的不同浓度的ENU工作液有固体部分和1L无菌蒸馏水组成，其中固体组分含量按重量百分比由以下组分组成 

ENU            1%~2%

NaOAc          1%~2%

KCl             3%~6%

 NaCl            65%~80%

NaHCO₃              2%~5%

NaH₂PO₄·7H₂O    1%~2%

MgSO₄·7H₂O      1%~2%

MgCl₂·6H₂O       1%~2%

KH₂PO₄          1%~2%

CaCl₂                   1%~2%

葡萄糖           8%~15% 。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是： 

ENU工作液在诱导草鱼基因DNA突变中的应用。

本发明优点在于：采用ENU化学诱变剂浸泡受精卵和处理精子的方法均能产生一定比例发育正常、快速生长的个体，该方法可成功用于草鱼的育种工作，大大缩短草鱼的育种周期。 

【附图说明】

图1A显示在mstn1基因编码框的190bp到252bp区域中，一个个体(编号：690 000 116 601 909，见图3B)在205nt的C突变成T和另一个个体（编号：690 000 116 601 814，见图3A）在239nt的A突变成G的基因改变图。

图1B显示在mstn1基因编码框区域中个体(编号：690 000 116 601 909，见图3B)在205nt出的C变为T导致的第69位编码谷氨酰胺产生终止密码子，造成密码子的无义突变。