[发明专利]一种通过同源重组敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型及其构建方法

权利要求书

1.一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，其特征在于该菌株是通过失活Mortierella alpinaATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。

2.根据权利要求1所述的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，其特征在于：ura5基因的失活是通过缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而实现的。

3.一种制备权利要求1或2所述的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的方法，其特征在于，通过同源重组使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失从而使ura5基因失活，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为：首先获得ura5敲除基因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4KOura5，然后用重组质粒pBIG4KOura5转化根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4KOura5的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所使用的根癌农杆菌为：Agrobacterium tumefaciensC58C1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，基因敲除使用的根癌农杆菌起始载体为：pBIG2RHPH2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，基因敲除载体构建的具体步骤如下：

1）用PCR的方法获得质粒pBluescript II SK⁺的MCS基因片段；

2）用限制性内切酶EcoRI和XbaI对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行酶切，并通过连接反应将MCS基因片段插入质粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位点之间得到质粒pBIG4；

3）用融合PCR的方法获得并连接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段；

4）用限制性内切酶EcoRI和KpnI对敲除基因片段和质粒pBIG4进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒pBIG4获得pBIG4KOura5。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3）中的敲除基因片段是通过下述步骤获得的，

首先根据NCBI数据库设计如下引物

P1：GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC

P2：TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG

P3：TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT

P4：TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG

然后以高山被孢霉ATCC32222基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分别扩增上下游片段，再以上下游片段为模板，在反应体系中加入P1、P4进行融合PCR反应，获得KOura5敲除基因片段。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，根据质粒pBluescriptIISK⁺的序列信息设计如下引物：

MCS上游：TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT

MCS下游：AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG

然后用PCR的方法获得步骤1）中的质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的根癌农杆菌介导的基因敲除方法是采用根癌农杆菌转化高山被孢霉，具体为：取100μL根癌农杆菌与100μL高山被孢霉孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸IM固体培养基上，进行转化培养，然后筛选获得高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于根癌农杆菌转化高山被孢霉的具体步骤如下：

（1）取保存于-80℃的含有质粒pBIG4KOura5的根癌农杆菌C58C1于含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线；30℃倒置避光培养48小时；

⑵挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体YEP培养基中30℃，200rpm避光培养24-48小时；

⑶4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清，加5mLIM培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清，加2mLIM培养基重悬菌体；

⑷用IM培养基调整菌浓度至OD600=0.9，30℃，200rpm避光培养至ＯＤ600＝1.5；

⑸收集高山被孢霉孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到10⁶个每100μL；

⑹取100μL根癌农杆菌与100μL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸IM固体培养基上，23℃避光培养48-96小时；

⑺将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上，25-30℃培养至产生大量孢子。