[发明专利]一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞遗传学和分子生物学技术领域，涉及一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法。

背景技术

核糖体RNA基因(rDNA)是植物基因组中研究最广泛的遗传单元之一，rDNA是高度保守的重复序列家族，拥有几百乃至几千个拷贝，成簇分布于一对或多对染色体上。通过荧光原位杂交(FISH)技术将rDNA在染色体上进行定位，可以为核型分析提供有效的细胞学标记，特别对于染色体较小且形态相近的物种，这种染色体标记更是核型分析的重要工具。

5S rDNA探针一般采用质粒或PCR扩增获得，再进行直接或间接标记用于FISH，目前还没有利用荧光基团标记的的寡核苷酸探针在植物染色体上进行5S rDNA FISH定位的报道。

发明内容

本发明公开了一种rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法。本发明的方法是利用荧光基团标记的寡核苷酸探针在植物染色体上进行rDNA FISH定位。具体地说包括如下步骤：

1. 染色体标本制备

（1）按常规植物材料培养，待种子或植株根尖长至0.5-1cm；

（2）切下生长旺盛的根尖，用饱和对二氯苯溶液室温下预处理3-5小时；

（3）吸去预处理液，根尖用蒸馏水或0.075mol/L 氯化钾低渗30min，然后用3:1（甲醇:冰醋酸）固定20min-1小时；

（4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液；

（5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时； 

（6）蒸馏水洗去酶液，后用0.075mol/L 氯化钾后低渗15-30min，用3:1甲醇：冰醋酸固定液固定20min；

（7）取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥；

（8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色10min，自来水冲洗凉干；

（9）镜检，选择分散良好的染色体标本放在-20℃冰箱中保存待用；

2. 5S rDNA探针制备

从拟南芥5S rDNA序列中选取一段20个碱基左右的高度保守序列，合成时在探针的5’或3’端连接一个荧光基团：

5’- CTGATGGGATCCGGTGCTTT -3’ （ SEQ NO:1） ，5’端带红色荧光标记TAMRA（5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯）；

3. 染色体荧光原位杂交：

A：染色体标本预处理 

（1）在荧光显微镜上记下已标记分裂相的坐标，并用玻璃刀在载玻片背面标记分裂相的位置；

（2）将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥；

B：染色体标本变性

（1） 在标记处加30μL 70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中70℃处理2min；

（2）去掉盖片，-20℃的70%、85%、100%冷乙醇脱水，每级3min，空气干燥；

C：杂交 

（1）用2×SSC稀释探针至5ng/μL；

（2）每张标本加10μL探针，并盖18×18mm的盖玻片；

（3）于湿盒中37℃杂交1-2小时；

D：杂交后洗脱 

（1）在4×SSC，0.2%Tween 20中室温下避光洗涤10min；

（2）蒸馏水冲洗片刻，避光空气干燥；

E：杂交信号检测 

（1）滴加3μL含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片；

（2）Nikon 80i荧光显微镜观察，按照所记录的标本坐标在紫外光激发下可观察到蓝色的染色体，在绿色激发光激发下可观察到红色的5S rDNA杂交信号；

（3）SPOT RT KE冷CCD进行图像采集，SPOT 4.1软件进行图像合成。 

本发明公开的5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

  （1）探针制备方面，本发明的探针为寡核苷酸探针在合成时可加入荧光基团修饰，不用再进行标记，与现有技术相比方法简单、成本低廉。

（2）寡核苷酸探针很容易渗透进入染色体，所以染色体标本预处理步骤可简化。

（3）寡核苷酸探针不需要变性，杂交液的成分仅为2xSSC，比经典方法成分简单很多。