[发明专利]用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体

说明书

本发明涉及一种酮还原酶突变体，其源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶，能将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，具有A94S，F147V，L199P，A202V中的一个或多个突变。本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2‑20倍，利用该酶可生物催化将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；此外反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

技术领域

本发明涉及酮还原酶突变体及其在他汀类药物中间体生产中的应用，特别涉及一种源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的酮还原酶突变体及其在手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯生产中的应用。

背景技术

阿托伐他汀钙（商品名LIPITOR由辉瑞公司销售）、罗苏伐他汀钙（商品名CRESTOR由阿斯利康公司销售）以及匹伐他汀（商标名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本销售），是重要的降胆固醇他汀类药物。而手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。国内2009年该中间体的产量为400吨，预计未来几年内，国内产量将达到1000吨以上，直接经济效益在数亿元。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备及手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉 20小时仅可转化 1g/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶催化活性高的酮还原酶及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)中天然存在的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)。本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)产生的野生型酮还原酶 (SEQ ID NO：2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型 KRED酮还原酶”指由源自开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶基因SEQ ID NO：1编码的，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物 (例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物 (例如S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化率增加的酮还原酶。

本发明提供的用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，其特征在于，其是源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶，其中，突变是在亲本酮还原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在亲本酮还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，且与使用亲本酮还原酶相比，其酮还原酶活性增强2-20倍。

进一步地，所述突变体具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：A94S， F147V，L199P，A202V。