[发明专利]一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法

权利要求书

1. 一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法，其特征是按以下步骤：

(1) 生物素化标记蛋白酶的制备：称取一定量的生物素，用适量pH5.5、0.02M PBS缓冲液溶解，按生物素与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1:3:3比例混合，于室温下反应1.5 h；以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中任意一种酶溶于磷酸盐缓冲液中配制蛋白酶溶液，将活化的生物素与蛋白酶摩尔比3:1比例混合，调整至酶最适pH值，于4℃下反应过夜后，用PBS缓冲液透析除去未反应的生物素，透析产物加入甘油于-20℃下保存备用；

(2) 链霉亲和素偶联磁珠：取一定量的羧基化的磁珠，依次用无水乙醇、NaOH、HCl 及PBS缓冲液洗涤后，用PBS缓冲液重悬磁珠，按磁珠表面羧基与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺摩尔比为1:3:3分别加1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃振荡反应2 h 活化磁珠表面羧基。

2.磁珠通过磁架回收，并用PBS缓冲液洗涤三次后，重悬于PBS缓冲液中；活化后的磁珠加入含链霉亲和素pH8.0的PBS缓冲液37℃反应2 h，最后反应产物加入乙醇胺室温封闭2 h；磁架回收磁珠，PBS缓冲液洗涤三次后，重悬于含0.05%叠氮钠的pH8.0的PBS缓冲液中，4℃保存备用；

(3) 固定化酶的制备：固定化酶利用链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶结合反应制备，反应体系中链霉亲和素磁珠与生物素化蛋白酶的摩尔比为1:1-1:4，反应在37 ℃下振荡孵育20 min，经磁力架进行磁分离，移除上清液，回收磁珠，即得固定化酶；

(4) 将蛋清蛋白溶液与缓冲溶液按一定比例混合均匀，之后转移至水解罐，调节水解液的温度，控制温度为37-60℃，pH值6.0-8.0，然后按酶活与蛋白底物的比例为5000-30000 U/g蛋白质加入固定化酶，混匀后于恒温水浴锅中水解，期间不断搅拌，并控制酶解体系的pH值6.0-8.0，水解时间为2.0-4.0 h，反应结束后经磁力架进行磁分离，收集蛋清蛋白酶解液；

(5) 在步骤（4）收集的蛋清蛋白酶解液中加入0.5-3.0%食品级粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得上清液；

(6) 将步骤（5）所处理的酶解液在真空度为0.08 MPa、温度为50℃进行真空浓缩，浓缩至固形物在60%以上；

(7) 将步骤（6）所得蛋清水解多肽浓缩物在-40 ℃预冻12 h，冷阱温度为-65℃，真空度100 Pa，加热板温度50 ℃，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏蛋清蛋白粉。