[发明专利]基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测方法，特别涉及一种基于核酸适体的快速检测方法。

背景技术

近年来，国内外的公共健康安全事件层出不穷，尤其是食源性病原微生物污染引起的食品安全事件，不仅严重影响了市场秩序，而且还给公众带来了无处不在的恐慌。根据世界卫生组织的统计，有三分之一的发达国家居民每年会出现食源性疾病感染症状，而这个比例在发展中国家则高达二分之一，全球每年发生300-1000万件食源性疾病死亡案例。此外，由于地震、洪水等灾害事件影响，污水淤积、开放式垃圾堆等因素都极有利于细菌等病原微生物的滋生，这些因素都大大提高了灾区传染病暴发流行的可能性灾情发生。因此，发展简易、 快速的病原微生物检验方法对于公众健康和食品安全监管非常重要。

目前病原微生物常见的检测方法包括微生物培养法、免疫学方法、和分子检测方法。传统的微生物培养法耗时较长、效率较低；而免疫学检测方法灵敏度不足；分子检测方法是直接对病原体的核糖核酸或脱氧核糖核酸的检测，无论是在定性或者定量方法都有一定的优势。尽管核酸检测方法具有高灵敏度、高特异性的优点，但是它们需对病原微生物的核酸进行提取，操作繁琐，而且需要特殊的仪器用需要专业的培训。此外，核酸检测方法只针对残留的核酸，不能精确反应病原微生物的完整性，在病原体死亡破碎的情况下仍能检测出假阳性结果。因此，人们仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作简易的检测工具。

核酸适体（aptamer）指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。

核酸适体（Aptamer）是一类新型的识别分子，其分子量较低（15-50碱基），没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输。核酸适体是以SELEX 技术，通过重复选择的过程从化学合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的。用以筛选核酸适体的靶物质有蛋白质、多肽、糖、核酸、有机小分子、离子、细胞以及病毒颗粒等，理论上任何分子都能找到其相应的适体。当以纯的靶分子筛选，可得到多种特异的适体，利用这些适体就可以建立该分子的系列分析方法；当以肿瘤细胞为靶物质，则可同时筛选到细胞表面多种靶分子的特异适体，而无需事先了解这些靶分子，得到的适体则可作为分子探针检测特定肿瘤，同时还可用来纯化、鉴定其靶分子从而发现新的生物标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核酸适体的快速检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

基于核酸适体的快速检测方法，包括如下步骤：

1)      设计得到两种针对待检物的核酸适体，记为A1和A2，在A1的5’端连接有等温链置换扩增引物序列及切刻酶识别位点，在A2的一端修饰有分离标记，得到修饰后的核酸适体A1和A2； 

2)      将修饰后的核酸适体A1和A2与样品混合，充分反应，之后利用A2上的分离标记将样品富集、分离，得到浓缩样品；

3)      将浓缩样品置于含有切刻酶的等温链置换扩增反应体系中进行等温扩增；

4)      检测扩增得到的ssDNA的量，确定待检物的浓度。

分离标记选自特异性小分子标记、固相载体。

作为本发明的进一步改进，使用单链核酸快速检测试纸检测扩增产物中是否存在扩增得到的ssDNA。

作为本发明的进一步改进，等温链置换扩增反应体系中的等温链置换酶为无外切核酸酶活性的嗜温 DNA 聚合酶。

一种快速检测试剂盒，包括如下组分：

1)      两种针对待检物的修饰核酸适体A1和A2，A1的5’端连接链置换扩增引物序列及切刻酶识别位点，A2的一端修饰有分离标记；

2)      用于扩增A1的等温链置换扩增反应体系，所述等温链置换扩增反应体系中含有切刻酶；

3)      用于检测扩增产物ssDNA的核酸快速检测试纸。

分离标记选自特异性小分子标记、固相载体。

作为本发明的进一步改进，等温链置换扩增反应体系中的等温链置换酶为无外切核酸酶活性的嗜温 DNA 聚合酶。

本发明的有益效果是：

本发明方法具有操作简便，无需对待测样品进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，检测结果准确可靠，特别适用于基层及偏远地区使用。