[发明专利]一种快速高效的植物寄生线虫总RNA提取方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种新的快速高效的植物线虫总RNA提取方法。

背景技术

总RNA提取技术是植物线虫分子生物学研究中的重要技术，是开展植物线虫基因克隆、转录组学和小RNA等分子生物学研究的技术基础。目前，有多种用于植物线虫总RNA提取的方法及试剂盒，比如TRIzol法和多种已商品化的动物组织总RNA提取试剂盒。例如，Rosso等人(Rosso,M.N.,B.Favery,et al.Isolation of a cDNA encoding a beta-1,4-endoglucanase in the root-knot nematode Meloidogyne incognita and expression analysis during plant parasitism.Molecular Plant-Microbe Interactions,1999,12(7):585-591.)、Uehara等人(Uehara,T.,A.Kushida,et al.PCR-based cloning of two beta-1,4-endoglucanases from the root-lesion nematode Pratylenchus penetrans.Nematology,2001,3:335-341.)、Haegeman等人(Haegeman,A.,J.Jacob,et al.A family of GHF5endo-1,4-beta-glucanases in the migratory plant-parasitic nematode Radopholus similis.Plant Pathology,2008,57(3):581-590.)和Haegeman等人(Haegeman,A.,T.Kyndt,et al.The Role of Pseudo-Endoglucanases in the Evolution of Nematode Cell Wall-Modifying Proteins.Journal of Molecular Evolution,2010,70(5):441-452.)分别应用TRIzol法提取南方根结线虫Meloidogyne incognita、穿刺短体线虫Pratylenchus penetrans、香蕉穿孔线虫Radophus similis和非洲茎线虫Ditylenchus africanus总RNA。Yan等人应用RNA提取试剂盒Cs-TFA RNA extraction kit(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,U.S.A.)从1mL大豆孢囊线虫Heterodera glycines侵染前二龄幼虫（J2）中成功提取总RNA用于大豆孢囊线虫cDNA文库的构建(Yan,Y.T.,G.Smant,et al.Functional screening yields a new beta-1,4-endoglucanase gene from Heterodera glycines that may be the product of recent gene duplication.Molecular Plant-Microbe Interactions,2001,14(1):63-71.)。Grenier等应用试剂盒RNeasy Plant分钟i kit(Qiagen)从200000头马铃薯白线虫Globodera pallida J2提取总RNA用于线虫ds cDNA的合成(Grenier,E.,V.C.Blok,et al.Identification of gene expression differences between Globodera pallida and G-'mexicana'by suppression subtractive hybridization.Molecular Plant Pathology,2002,3(4):217-226.)。Wubben等人应用试剂盒RNeasy Plus分钟iKit(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA)从肾形肾状线虫Rotylenchulus reniformis雌虫中提取总RNA(Wubben,M.J.,F.E.Callahan,et al.Transcript analysis of parasitic females of the sedentary semi-endoparasitic nematode Rotylenchulus reniformis.Molecular and Biochemical Parasitology,2010,172(1):31-40.)。Gao等人应用mRNA纯化试剂盒Oligo(dT)25magnetic beads(Dynal,Lake Success,NY,U.S.A.)从大豆孢囊线虫不同龄期的食道腺细胞抽取物中纯化mRNAs用于食道腺特异cDNA文库的构建(Gao,B.L.,R.Allen,et al.The parasitome of the phytonematode Heterodera glycines.Molecular Plant-Microbe Interactions,2003,16(8):720-726.)。Huang等人应用上述mRNA纯化试剂盒从南方根结线虫中纯化mRNAs用于后续的ds cDNA第一链的合成(Huang,G.Z.,R.H.Dong,et al.Developmental expression and molecular analysis of two Meloidogyne incognita pectate lyase genes.International Journal for Parasitology,2005,35(6):685-692.)。