[发明专利]一种抗肿瘤血管生成单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗肿瘤血管生成单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤血管生成单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

细胞受体蛋白VEGFR2的表达纯化、制备全人源化噬菌体Fab抗体库、从噬菌体抗体库中筛选高亲和力抗体、将纯化的VEGFR2固定在Biacore的CM5芯片上，分别测试不同浓度的AVR2抗体与VEGFR2的结合和解离速度；

以抗体和抗原高亲和力和高特异性为基础的抗体库筛选；

将抗体基因克隆到表达细胞、构建高表达量工程细胞株、抗血管生成的检测及评价。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤血管生成单克隆抗体的制备方法，其特征在于，VEGFR2胞外区即VEGFR2-ECD的基因克隆的具体方法为：

步骤一、收集VEGFR2胞外区序列；

步骤二、设计引物：N端加His-tag；C端加F，酶切位点BamH I、Hind III；

步骤三、以VEGFR2为模板，扩增出胞外区；

步骤四、克隆到PET28a；

步骤五、挑取单克隆测序；

步骤六、将VEGFR2克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，并与抗体的Fc区整合表达；

步骤七、用Protein A-beads对VEGFR2-ECD-Fc进行亲和纯化；

步骤八、纯化后的蛋白进行凝胶过滤，进一步去除杂蛋白。

3.如权利要求1所述的抗肿瘤血管生成单克隆抗体的制备方法，其特征在于，制备全人源化Fab抗体库的具体方法为：

步骤一、淋巴细胞的分离：

取当天采集的抗凝血150份，每份1mL，取3份血样混匀，1∶1用生理盐水稀释；

15mL的离心管中加入6mL的淋巴细胞分离液，沿管壁轻轻加入6mL稀释后的血液，400g、1500r/min离心15min；

用移液枪吸取淋巴细胞层，置于另一离心管，液体分层，从上至下依次为血浆、淋巴细胞层、分离液以及红细胞层，颜色依次为黄色、白色、无色透明、红色；

加6mL生理盐水洗涤细胞，500g、1800r/min离心20min，弃上清，重复一次，收集沉淀即为淋巴细胞；

步骤二、细胞总RNA的提取：

向淋巴细胞中加入400μLTrizol，用移液枪反复吹打，室温裂解15min，转移至用DEPC水处理的EP管中，每管加入80μL氯仿，Vtrizol∶V氯仿＝5∶1，剧烈震荡15s，室温静置5min；

置于高速冷冻离心机，4℃、12000r/min，离心10min；

吸取上层水相置于另一个EP管中，加入200μL预冷的异丙醇，涡旋振荡，沉淀出RNA，室温下培育20min；

4℃、12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用200μL预冷的75％乙醇清洗，4℃、7500r/min离心5min，弃上清，干燥3-5min；

30μL DEPC处理的双蒸水重悬干燥后的RNA，-70℃长期保存，也可进入cDNA合成步骤；

紫外吸收法检测RNA纯度和浓度；

步骤三、cDNA的合成：

cDNA的合成的具体步骤如下：

配制RT反应液，反应液配置在冰上进行；

轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：

37℃  15min  反转录反应，

85℃  5sec  反转录酶的失活反应，

4℃  保存；

将反转录后获得的cDNA混匀，置于-20℃保存，也可以进入PCR步骤；

步骤四、可变区基因的扩增：

第一轮PCR扩增

以cDNA作为模板，进行可变区基因的第一轮PCR扩增，其中，对于来源于IgM的HC可变区的扩增，正向引物位于IgM恒定区，反向引物位于重链可变区的5’端；对于轻链的扩增，由于其存在κ和λ两种亚型，因此，需要按亚型分别设计引物，进行扩增，正向引物位于轻链恒定区的3’端，反向引物位于轻链可变区的5’端；

(1)反应体系：

(2)PCR条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，28循环；72℃10min，其中，重链产物使用9个独立的反应扩增获得，而轻链则产生6个独立的V_κC_κ扩增产物，11个V_λC_λ扩增产物(HuCλF1和HuCλF2引物被混合后加入同一反应)；

(3)扩增获得的PCR产物使用1.5％的琼脂糖凝胶进行纯化，使用Axygen的胶回收试剂盒进行胶回收；

第二轮扩增

100-200ng的第一轮PCR的产物作为该轮反应的模板，在100μL的反应体系中，进行可变区基因的第二轮扩增；PCR条件同第一轮扩增，但反应设置为25个循环，其中重链的第二轮扩增使用带有SfiI限制性内切酶位点的V_H-Back引物作为反向引物，以包含BstEII限制性内切酶位点的J_H-FOR引物作为正相引物；轻链V_κC_κ和V_λC_λ的第二轮扩增则使用添加ApaLI和AscI限制性内切酶位点的引物分别作为正向、反向引物；

步骤五、初级文库的构建：

用1.5％的琼脂糖凝胶纯化带限制性内切酶位点的PCR产物；

将不同VH家族的PCR产物等量混合，使用限制性内切酶SfiI和BstEII于50℃酶切；V_κC_κ和V_λC_λ的PCR产物，按轻链亚型混合，分别使用限制性内切酶ApaLI和AscI于37℃酶切，酶切反应16h；

使用Microcon-50去除酶切体系中的限制性内切酶，同时对酶切产物进行脱盐；

由1L的培养液中，使用质粒大提试剂盒提取噬菌粒载体，使用SfiI和BstEII以及ApaLI和AscI酶切大约400μg的DNA，使用1％的琼脂糖凝胶纯化载体；

在100-200μL体系中，将相应的载体1-5μg和PCR片段0.1-1.5μg室温下，在T4DNA连接酶(9U)作用下连接16h，并使用Microcon-50对连接产物脱盐；

将连接产物分装成20-40ul/小管，用其电转化100-150ul新鲜制备的TGI感受态细胞，转化完毕后，往电转杯中加入1mL2TY-GLU培养基，将细胞转移至1.5mL的EP管；用培养基将细胞梯度稀释至10^-3、10^-4、10^-5和10^-6，分别取100ul涂布LB-AMP-GLU平板、9cm半径从而测定文库的容量；剩余的转化产物涂布于24*24CM的LB-AMP-GLU平板，37℃过夜培养；

将平板上的菌刮下，用2TY-AMP-GLU培养基制成OD₆₀₀为50-100的菌悬液；添加终浓度为20％的甘油，测定OD₆₀₀并将其存放于-80℃，作为初级文库；

步骤六、二级文库的构建：

将独立的初级文库的甘油储液解冻，将不少于文库大小10倍的菌量接种于1L的LB-AMP-GLU液体培养基；培养8-16h后，使用大提试剂盒提取质粒；

使用限制性内切酶SfiI和BstEII消化来源于重链和轻链文库的质粒DNA，重链可变区片段V_H使用1.5％的琼脂糖凝胶纯化，而来源于轻链文库的载体使用1％琼脂糖凝胶纯化；

优化连接和电转化时载体与片段的比例；

扩大连接反应的体系，将连接产物转入新鲜制备的TGI感受态细胞中，产生最终的文库；抗体库按照轻链的亚型分成κ库和λ库分别保存；

步骤七、噬菌体的制备：

使用稀释不同倍数的M13K07、VCSM13噬菌体感染指数生长期的TG1细菌，37℃，培养30min，接种于2TY平板顶层；

取一个噬菌斑，重悬于3mL的2TY培养基中，添加30μL过夜培养的TGI，37℃，培养2h；

用1L的2TY培养基稀释培养物，培养1h，随后添加终浓度为50μg/mL的卡拉霉素，37℃，培养16h；

5000g、离心10min，去除细胞，通过往上清中添加0.25体积的噬菌体沉淀剂，沉淀噬菌体，在冰上放置30min后，5000g，离心10min收集噬菌体颗粒，用5mL的PBS重悬颗粒，并使用0.22μm的滤膜过滤；

在含有100μL TGI的2TY顶层琼脂平板上，测定辅助噬菌体的pfu，将噬菌体储液的浓度稀释到1×10¹³pfu/mL，分装后存于-20℃；

在从Fab文库中制备噬菌体前，需要将甘油菌按文库的大小进行混合，确保在最终的文库中每个克隆存在不小于10个菌株，将文库接种于ATY-AMP-GLU培养基中，使菌株生长到指数期；

37℃培养至OD600达到0.5-0.9，收集不少于库容量十倍的菌体培养液，添加辅助噬菌体感染复性为10-20，感染的细胞37℃静置30min，随后摇床摇动30min；5000g、离心10min，收集被感染的细胞，重悬于含有100μg/mL氨苄霉素和25ug/mL卡那霉素的2TY培养基，30℃，培养16h；

从发酵液上清按步骤4培养中沉淀噬菌体颗粒，按50mL/L培养基的比例重悬噬菌体颗粒于PBS中，5000g，离心10min，去除细胞碎片；采用第二个聚乙二醇沉淀，去除未连接到噬菌体颗粒上的抗体片段；按5mL/L培养基的比例用PBS重悬颗粒，离心，使用0.45um滤膜过滤；添加等量的甘油，将噬菌体悬液存于-80℃；

用50％甘油/PBS溶液调整噬菌体储液的浓度，使其达到10¹³转染单位/mL；将储液以每管1mL的量分装，存于-80℃；每轮筛选使用一管；通过聚乙二醇沉淀的方法去除甘油，将噬菌体重悬于1mL后期筛选所需使用的缓冲液中。