[发明专利]利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法

权利要求书

1.一种利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法，其特征在于，包括步骤：

1）将红平红球菌作为生产菌种，并接种于含碳源和氮源的种子培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得适于接种的种子；

2）将步骤1）所得种子接种于转化培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得发酵液；

3）在步骤2）所得的发酵液中投入雄烯二酮溶液，继续在150～350rpm转速下，26～35℃培养48～96h，得到转化液，并检测转化液中的9α-羟基-雄烯二酮含量；

4）分离和提取步骤3）所得的转化液中的9α-羟基-雄烯二酮。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，红平红球菌为红平红球菌ATCC14887。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，含碳源和氮源的种子培养基中，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉或它们的组合，碳源的含量为0.5g/100mL～3g/100mL；氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、蚕蛹粉或它们的组合，氮源的含量为1g/100mL～6g/100mL；

种子培养基的pH为7.0～7.2。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，接种量为5～8vol%；

转化培养基的组分包括：碳源、氮源、无机盐和水；

其中，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉或它们的组合；碳源的含量为0.5g/100mL～3g/100mL；

氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、蚕蛹粉或它们的组合；氮源的含量为1g/100mL～6g/100mL；

无机盐选自镁盐、磷酸盐、钠盐或它们的组合；无机盐的含量为0.001g/100mL～0.1g/100mL。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述镁盐包括：硫酸镁和氯化镁；

磷酸盐包括：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；

钠盐包括：氯化钠和硝酸钠；

转化培养基的pH为6.8～7.5。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述转化培养基的配方为：水、葡萄糖0.5g/100mL～1.5g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL～1g/100mL、玉米浆2.5g/100mL～5.0g/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL～0.08g/100mL和硫酸镁0.01g/100mL～0.05g/100mL。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，雄烯二酮溶液中的第一溶剂选自甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或它们的组合；

雄烯二酮的投入量为20～45g/L发酵液；雄烯二酮溶液的投入方法为：用溶剂将雄烯二酮在80～90℃溶解后，在无菌条件下，投入至发酵液中；

检测转化液中的9α-羟基-雄烯二酮含量的方法包括：通过薄层层析或高效液相色谱进行检测。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，以雄烯二酮转化成9α-羟基-雄烯二酮的转化率达到90%以上时作为转化终点。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4）的具体步骤包括：

A、转化结束后，将转化液减压过滤，滤饼加入第二溶剂，加热回流至澄清；然后，过滤，保留滤液；

其中，第二溶剂包括：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或甲基异丁酮；

B、在步骤A所得滤液中，加入相当于投料底物雄烯二酮10wt～15wt%的活性碳，在55～105℃下搅拌脱色1～2h后，降至室温，过滤去除活性炭，得第一滤液，并用第二溶剂洗涤滤饼，得第二滤液，将第一滤液与第二滤液合并，然后，在40～60℃下减压浓缩、析晶、过滤、烘干，得9α-羟基-雄烯二酮。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤A中，滤饼还能重复加入第二溶剂，以获得滤液。