[发明专利]利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法

权利要求书

1.利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：将重组人第七凝血因子的cDNA导入或整合至家兔的基因组中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子。

2.根据权利要求1所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其包括以下步骤： ⑴将外接信号基因的重组人第七凝血因子的cDNA插入表达载体中形成第七凝血因子的乳腺表达载体，所述表达载体包括调控元件；⑵将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因中，获得转基因兔；⑶获得的转基因兔的当代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第七凝血因子。

3.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述表达载体为pBC1质粒载体，所述重组人第七凝血因子cDNA为人全序列第七凝血因子cDNA。

4.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述外接信号基因为β-酪蛋白信号肽和第七凝血因子原有的分泌信号肽。

5.根据权利要求2或3或4所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述调控元件包括鸡β球蛋白绝缘子,山羊β-酪蛋白启动子,TATA盒, β-酪蛋白外显子1,β-酪蛋白内含子1, β-酪蛋白外显子2,β-酪蛋白外显子7，8，9，β-酪蛋白内含子7，8，β-酪蛋白基因组片段。

6.根据权利要求5所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述重组人第七凝血因子的cDNA在限制性内切酶Xho I多克隆位点插入pBC1载体，所述限制性内切酶Xho I多克隆位点位于β-酪蛋白外显子2和β-酪蛋白外显子7，8，9之间。

7.根据权利要求6所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：在将所述乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成乳腺表达构件，所述乳腺表达构件包括所述调控元件和第七凝血因子cDNA。

8.根据权利要求7所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中；然后，将家兔受精卵放入FBS M199培养液、并在38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养；最后，将家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因兔。

9.根据权利要求7所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件转染至家兔供体细胞中，然后，将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎；最后，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因兔。

10.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期；所述人工诱导泌乳期和所述自然泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。