[发明专利]诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用诱导剂HGF和FGF联合高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法和应用。

背景技术

肝脏疾病是危害全世界人民健康的疾病，尤其我国是病毒性肝炎的高发区，由病毒性肝炎导致的重症肝炎死亡率可达50%—70%或更高。肝移植是终末期肝病有效的治疗手段，虽然劈离式、活体劈离式等各种肝移植术可以最大限度的利用供肝，但其操作复杂、患者需终生免疫，临床应用受到了极大的限制；并且由于肝源的缺乏，使得一部分患者在等待中死亡；而对于肝脏细胞体外分离培养方法、肝细胞再生及在肝脏损伤修复中的作用都尚待进一步的阐明。因此，寻求非肝源干细胞并促进其向肝细胞定向分化是亟待解决的重要问题。

肝组织工程的首要问题是寻找来源充足并有稳定的肝特异性功能的种子细胞。成熟肝脏细胞具有诸多不足而不能成为满意的细胞来源，例如，从肝功能衰竭获取肝脏细胞难度较大、异基因肝脏细胞可能产生免疫排斥反应、体外培养易失去活性与功能等。在过去30年中，研究者们发现肝干/祖细胞不但存在于原前肠胚层而且来源于囊胚内细胞群；既可自胎儿、新生儿、成体肝脏分离出，也可存在于肝外组织。

近年来，干细胞疗法成为组织胚胎学、医学伦理学等方面最为关注的焦点之一，又由于成体干细胞可塑性和横向分化的发现，干细胞临床应用成为当今干细胞组织工程、再生医学解决重要疾病的研究方向，于是，人们希望从间充质干细胞中找到解决肝脏疾病的治疗方案。

高浓度的肝细胞生长因子（HGF)可以体外诱导大鼠骨髓细胞分化为肝细胞，并表达ALB、CK18、CK8等。同时，大鼠和人的多能成体前体细胞在添加有HGF或成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）的培养基中进行培养，均可向肝细胞方向分化。

本发明建立了一种新的诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的方法，联合使用肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4，与目前的常用诱导方法相比，极大的提高了诱导效率，有助于为细胞移植治疗肝损伤提供更多更具活性的的种子细胞来源。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法。

本发明的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的方法，包括以下步骤：

  （1）配制诱导培养基：在IMDM培养基中添加40ng/ml 的HGF、10ng/ml 的FGF-4、1%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 ug/ml的链霉素和1 μg/ml的两性霉素；

（2）选取第5—10代的人脐带间充质干细胞，以5×10³/cm²的细胞密度接种于6孔培养板中，过夜培养；

（3）待细胞贴壁后，去除正常生长培养基，换为肝细胞诱导培养基，置于37℃，5% CO₂培养箱中；

（4）每3天换液一次，诱导培养21天，收获诱导后的细胞。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）所用的人脐带间充质干细胞来源于免疫系统尚未发育完善的新生儿脐带，所以人脐带间充质干细胞作为组织工程的种子细胞在进行移植后引起免疫排斥机率相对较小，而且由于脐带传统上作为医疗废弃物，所以脐带间充质干细胞的来源也具有易获得性。

      （2）所用诱导方法同时使用了HGF和FGF-4两种生长因子，并且优化了组合作用浓度，达到了诱导效率的最佳化。本发明是一种高效的将人脐带间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法，为治疗肝脏损伤提供了稳定可靠的移植细胞的来源。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是免疫荧光技术分析肝细胞特异性蛋白的表达，其中a、c、e为诱导组，b、d、f为诱导组。

图2 是Real-time PCR分析肝细胞特异性基因mRNA的表达。

具体实施方式

一、人脐带间充质干细胞制备。