[发明专利]包含滨麦1Ns、5Ns和6Ns染色体的小麦-滨麦多重异代换系的创制及原位杂交,SSR和PAGE鉴定

权利要求书

1.一种小麦-滨麦多重异代换系的创制，其特征在于：通过利用八倍体小滨麦M842-12(2n＝Sx＝56，AABBDDNsNs)与硬粒小麦(2n＝4x＝28，AABB)品种Trs-372杂交，在F1，F2，F3和F4世代均进行细胞学染色体镜检和基因组原位杂交(GISH)鉴定，筛选染色体数目为2n＝42，且含有滨麦Ns基因组染色体的单株，对筛选出的单株均套袋自交，在F5世代，选育出1个含有6条滨麦Ns基因组染色体的小麦-滨麦多重异代换系05DM6，根尖体细胞和花粉母细胞遗传学观察显示，05DM6的染色体构型为2n＝42＝21II，遗传稳定；根尖体细胞和花粉母细胞的基因组原位杂交鉴定显示，05DM6的染色体组成是由36条小麦染色体和6条滨麦Ns基因组染色体构成，且滨麦的6条Ns基因组染色体可以完全配对为3个二价体染色体；微卫星(SSR)分子标记分析表明，05DM6可能缺失了小麦D基因组的1D，5D和6D染色体，而含有滨麦Ns基因组的1Ns、5Ns和6Ns染色体；聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)研究表明，05DM6含有滨麦Ns基因组中的1Ns染色体；形态学分析显示，05DM6在株高、穗长、小穗数、结实率等农艺性状方面得到了明显的改善。

2.一种鉴定小麦-滨麦多重异代换系的方法，其特征在于包括以下：

1)细胞遗传学分析：Trs-372×M842-12的F5后代小滨麦多重异代换系05DM6，种子室内发芽，待根长至1～2cm时，剪取根尖于0～4℃冰水预处理24h，卡诺固定液固定，1％纤维素酶+1％果胶酶酶解，醋酸洋红染色压片；花粉母细胞观察：田间取适龄幼穗，用卡诺固定液固定，醋酸洋红染色压片，Olympus BX60显微镜观察；

2)基因组原位杂交：DNA提取及探针标记：采用CTAB法提取滨麦和华山新麦草全基因组DNA并进行标记，染色体制片及原位杂交，每张制片加40μl杂交液(包含20×SSC4μl，ssDNA(鲑鱼精DNA，5ug/uL)1μl，10％(W/V)SDS(十二烷基磺酸钠)1μl，50％(W/V)DS(硫酸葡聚糖)8μl，去离子甲酰胺20μl，探针DNA100ng，无菌去离子水加至40μl)。95℃变性8min，杂交在hybrite原位杂交仪上依照程序：75℃8min，37℃16h进行；

3)SSR标记分析：PCR扩增反应体系20μl，包含1×buffer(100mMTris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2)，0.2M dNTPs，50ng SSR引物，1U Taq DNA聚合酶，50～100ng模板DNA，94℃预变性3min，34个循环按照94℃变性1min，50，55或60℃退火1min，72℃延伸2min进行，最后充分延伸10min，扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，点样量8μl，150V恒压条件下电泳4～5h，硝酸银染色，数码相机照相保存结果；

4)PAGE分析：配制12％的分离胶和4.0％的浓缩胶，点样量为10μl，电极缓冲液pH8.3，每板胶恒定电流15mA，15℃电泳5h，考马斯亮蓝R-250染色过夜，自来水脱色，数码相机照相，凝胶浓度12％，凝胶交联度3.3％，点样量10μl，电极缓冲液pH3.1，每板胶恒定电压200V，电泳30min后调为400V，电泳5h，10％三氯乙酸溶液固定，考马斯亮蓝R-250染色，自来水脱色，数码相机照相；

5)形态学观察：统计八倍体小滨麦M842-12，硬粒小麦品种Trs-372，小滨麦多重异代换系05DM6及普通小麦品种7182的10个单株的株高和分蘖数，调查每个材料5个典型单株所有分蘖的穗长、小穗数、穗粒数、穗下茎节长度、旗叶大小性状，利用SPSS V13.0软件对各性状值的差异显著性进行方差分析。