[发明专利]红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类新化合物，具体涉及荧光染料领域，特别涉及一类红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用，特别是其在生物体系内的应用。

背景技术

钙离子在细胞的生命活动中起着重要作用，是机体各项生理活动不可缺少的重要离子，许多生理生化过程如信号传递、肌肉收缩、物质代谢、细胞正常代谢、细胞分化和增殖等都必须有Ca²⁺参与。随着人们对于钙代谢、钙通道、钙受体及其调控，钙的转运和利用以及某些疾病发生和发展关系的认识越来越深入，细胞内Ca²⁺浓度在时间和/或空间的变化已经成为细胞学、细胞生物学、神经科学研究的共同课题。因此，需要对钙离子浓度在细胞或亚细胞空间上进行更加准确的测定和获得更加合适的响应时间，而这些都是在不影响系统的生物学过程的情况下进行的。目前为止，所谓的荧光钙离子探针可以很好的满足这种需求，有一系列经过特殊设计的荧光染料，这些荧光染料通过螯合钙离子的同时产生荧光光谱性质的变化，这些变化可以是染料荧光强度或波长的改变，也可以是二者的同时改变。典型的，光谱的改变与钙离子浓度呈线性关系，因此可以对钙离子的浓度进行定量。

得益于Tsien及其合作者的开创性工作，目前已经产生了一系列具有不同荧光性质和钙离子解离常数的荧光探针。到目前已有三代钙荧光探针：第一代是20世纪80年代初合成的quin-2（Biochemistry,19:2396-2404）；后又合成了能用于双波长比率测定的第二代探针，即Indo-1和Fura-2(J.Biol.Chem.260:3440-3450；U.S.Pat.No.4,603,209)，这两代钙离子探针均需要紫外光激发；后来又合成了由可见光激发的第三代荧光探针，即Fluo-3(J.Biol.Chem.264:8179-8184)；后来又合成了Rhod-2(U.S.Pat.No.5,049,673)，以及分子探针公司的钙绿-1和钙绿-2(U.S.Pat.No.5,453,517)，这几种荧光探针的发射波长大多位于蓝光，绿光到黄光区域。

目前商业化的荧光探针仍然具有缺点：最主要的问题是它们的激发和发射波长相对较短。当使用短波长光（例如紫外光）进行激发时，许多细胞组分会发射蓝色荧光，这要归咎于所谓的自发荧光或背景荧光。紫外光激发还有可能引起细胞损伤，例如对DNA的破坏，因此对于活细胞探测，紫外光激发的染料并不合适。而可见光激发Ca²⁺荧光探针与紫外激发的Ca²⁺荧光探针相比，具有很多优点：可以被大多数基于激光的设备有效激发，包括激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪；可以有效避免由于紫外光激发而引起的对细胞的损伤和细胞自发荧光的干扰；细胞光损伤小，光散射较弱；当染料吸收很强时，可以减少染料的浓度，因此可以减少对活细胞的毒性；与光活化探针（锁笼）和其他UV光吸收的探针具有很好的相容性，可以增加多参数测定的选择性；随着钙离子浓度增加，荧光强度显著增加，可以更敏锐的检测Ca²⁺浓度的瞬间变化，在很多情况下，随着钙离子浓度增加，荧光强度变化越大，越有利于钙离子瞬变的检测。基于以上几点，可见光类的钙离子荧光探针Fluo-3和Rhod-2是对Indo-1和Fura-2的重大改进。其后开发的Calcium Orange和Calcium Crimson更是将Fluo-3和Rhod-2的光谱扩展到橙色光到红色光区域(U.S.Pat.No.5,453,517)。U.S.Pat.No.5,453,517描述的Calcium Orange，Calcium Crimson和其他类似的钙离子荧光探针与以前的钙离子荧光探针（例如Fura-2,Indo-1,Fluo-3和Rhod-2）具有根本的不同，在以前的钙离子荧光探针设计中，钙离子螯合剂部分直接与发色团部分相连。离子螯合剂部分与发色团直接相连的结果是对离子的螯合产生非常好的光谱响应。然而，Calcium Orange和Calcium Crimson的设计是将钙离子螯合剂部分与发色团通过共价连接基团相连。金属离子螯合剂与发色团的非直接相连使光谱对钙离子的螯合响应较低。

总之，虽然钙离子荧光探针的开发已走过了30年的历程，但仍然需要开发出具有高度灵敏性同时具有长波吸收和长波发射的新型钙离子荧光探针，同时需要开发出一系列具有不同钙离子解离常数的荧光探针，从而满足体系、细胞以及组织内钙离子测定的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种新型化合物（即通式（Ⅰ）化合物），此化合物可作为非透膜荧光探针；