[发明专利]感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法

说明书

技术领域

 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法。

背景技术

 细胞培养是将细胞置于体外条件下进行生长和繁殖，并可直接观察其细胞的形态结构和细胞生长周期等生命活动。培养的细胞独立生存于人工模拟的环境内，但该环境与真实的体内环境相比有很大差异。为了能够建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外培养环境与体内环境相吻合，使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，人们在细胞培养技术的基础上创建了细胞共培养技术。细胞共培养技术是将两种或两种以上的细胞共同培养在同一环境中的技术，目前主要有两种方法：① 直接共培养体系，即将两种或两种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触；② 间接共培养体系，即将两种或两种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。细胞共培养技术，具有更好地反映体内环境的优点，该方法已被广泛应用在现代细胞研究中。

目前，在胚胎干细胞治疗致盲性眼病的基础与临床转化研究中，两种或两种以上细胞间的共培养远远不能满足实验的要求。

发明内容

为了模拟体内环境条件，直接观察和检测胚眼来源的感光前体细胞移植后，跟踪移植胚眼来源的感光前体细胞的存活、增殖、分化和功能重建的轨迹，本发明提供了一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

 设计一种感光前体细胞与视网膜组织体外共培养方法，包括如下步骤：

（1）在插入式细胞培养皿的上室的物质交换膜上制备胚眼来源的感光前体细胞层；

（2）制备变性视网膜神经细胞层；

（3）将上步所得变性视网膜神经细胞层的内层即内界膜朝上，变性残留的部分光感受器细胞层向下放置在步骤（1）中所述的感光前体细胞层上；        

（4）在所述插入式细胞培养皿的下室制备视网膜色素上皮层；

（5）构建体外视网膜组织与细胞的共培养体系，在插入式细胞培养皿中添加体外共培养所需的培养液至变性视网膜神经细胞层上面4～8mm，放置37℃， 5℅CO₂培养箱，每48～60小时换一次培养液。

在上述步骤（1）中可采用如下具体方法制备感光前体细胞移植层：

将经鉴定和纯化合格的胚眼来源的视网膜感光前体细胞进行荧光标记，根据眼球种属来源和移植对象的不同制备出不同浓度的细胞悬液，即小鼠制备出含有0.25～0.5×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、大鼠制备出含有1×10⁶个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、新西兰兔和香猪制备出含有1×10⁷个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液、猕猴和人制备出含有1～1.2×10⁸个感光前体细胞/移植单位的细胞悬液；取一个移植单位的所述细胞悬液均匀的对应的放置在与其细胞数目相一致的插入式细胞培养皿上室的物质交换膜上，放置37℃，5℅CO₂培养箱内培养60分钟后，使感光前体细胞均匀排列至8～10层。

在上述步骤（2）中，可采用如下具体方法制备变性视网膜神经细胞层：

在5秒内快速完整的取出离体眼球的变性视网膜神经层，并将该视网膜神经层以视盘为中心切成四瓣形，切口从视网膜的周边部开始至赤道部内1～2mm，将视网膜神经细胞层的内层朝上、变性残留的部分光感受器细胞层向下放置在所述插入式细胞培养皿的上室孔内物质交换膜的感光前体细胞上。

上述胚眼来源的感光前体细胞与所述变性视网膜神经细胞属于同一个种属。

在上述步骤（4）中，可采用如下具体方法制备视网膜色素上皮层：

选择与实验组种属相同遗传背景的胚眼来源视网膜干细胞诱导定向分化的视网膜色素上皮细胞，通过各项微生物检测合格和细胞活性检测合格后，按照不同的实验对象，获取相匹配数量的视网膜色素上皮细胞，选择合适的插入式细胞培养皿，将细胞的放置于所述插入式培养皿的下室。

在上述步骤（4）中，所述视网膜色素上皮细胞的数量根据眼球种属来源和移植对象的不同而有异，即小鼠为1～1.5×10⁴个，大鼠为2～2.5×10⁴个，新西兰白兔和香猪均为2～2.5×10⁵个，猕猴和人均为2～2.5×10⁶个。