[发明专利]从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗氧化、抗肿瘤蛋白结构功能域的制备方法，尤其是一种从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法。 

背景技术

真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor leetin from edible Mushroon Agroebe aegerita[J]．Bioehem J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-40]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取所表达的蛋白具有对抗氧自由基的抗氧化酶、可诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段相关报道。 

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法。 

本发明的技术解决方案是一种从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法，其特征在于依次按如下步骤进行： 

a.  提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b.  将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c.  PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板，以插入BamHⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物BamHⅠ：

( 5′-3′)GGCTGATATCGGATCCCTTGCCCAAGATCTTACCG

下游引物XhoⅠ：

( 5′-3′)GGTGGTGGTGCTCGAGGTCGGGGCAGTGAGGAATT；

d.回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化750  bpMarker附近的明

显条带，切胶回收DNA片段。

所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，室温放置5min，然后加入氯仿，温和震荡后，4?C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静止15min，再次4?C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。 

所述c步骤的PCR反应体系50 ul：Premix Taq 25 μl，cDNA模板2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，灭菌蒸馏水21μl；反应条件：95℃预变性6min；94℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。 

本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-3基因片段，该基因片段所表达的蛋白具有对抗氧自由基的抗氧化酶，诱导肿瘤细胞凋亡等多种生物学功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET32-a原核表达体系中进行高效的可溶性表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。 

附图说明

图1是本发明实施例所提取的香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA1.0%琼脂糖凝胶电泳图。