[发明专利]一种羊关节炎-脑炎病毒前病毒DNA实时荧光PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸检测领域，特别涉及一种检测山羊外周血淋巴细胞中山羊关节炎-脑炎病毒前病毒DNA的实时荧光PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

山羊关节炎一脑炎(CAE)是由反转录病毒科慢病毒属山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)引起的山羊的慢性传染病，临床症状以山羊羔的脑脊髓炎和成年山羊的多发性关节炎、硬结性乳房炎以及间质性肺炎为特征。本病在全球广泛分布，加拿大、美国、澳大利亚、瑞士以及法国等国家的血清学阳性检出率最高可达65％～77％。我国于上一世纪80年代在进口种山羊时曾带入本病，因此，对国外进口种山羊实行严格的进境检疫，是防止本病传入我国的根本措施之一。CAEV为有囊膜的单股正链RNA病毒，在分类上属于反转录病毒科慢病毒属成员，CAEV基因组结构组成复杂，病毒以前病毒的形式整合到宿主染色体DNA上，前病毒基因组全长9189nt，由两端的长末端重复序列、结构基因gag、pol、env和调节基因vif、tat和rev组成。CAEV主要含有4种结构蛋白，分别是核心蛋白P28、P19、P16及囊膜糖蛋白gP135。自然感染情况下，CAEV病毒先通过消化道侵入动物体内，然后进入血液，感染血中单核细胞，此时病毒将基因组整合到宿主染色体内，潜伏于单核细胞内并不复制。感染的单核细胞侵入脑、关节、肺和乳腺等靶器官组织，在单核细胞转化为巨噬细胞的过程中，病毒开始复制释放子代的CAEV，使得巨噬细胞不能有效识别清除CAEV反而成为CAEV的免疫保护屏障，因此CAEV可以终生潜伏在患病羊体内。随着子代病毒的不断复制和释放，CAEV在患病羊体内形成持续性感染，并成为重要的传染源。对CAE病原鉴定，可用患关节炎山羊滑膜进行移植分离，或从山羊的外周血、奶和抽出的关节液的白细胞制备物中分离，然后应用间接荧光抗体试验或间接免疫过氧化物酶试验检测病毒。病毒分离培养方法不仅周期长，操作烦琐，而且也不易成功。

目前CAEV的广泛传播主要方式引种和活羊贸易，而无论是是出入境还是活羊贸易市场都缺乏严格的检疫措施，因此建立灵敏、高效的检测方法以加强检疫，有利于及时控制CAEV感染。采用PCR、Southern印迹以及原位杂交技术，可检测CAEV前病毒DNA中的特异性核酸序列，尤其适用于对血清学不能确诊的病例进行感染状态的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性的、检测山羊外周血淋巴细胞中山羊关节炎-脑炎病毒前病毒DNA的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

本发明试剂盒包含有：实时荧光PCR预混液、上游引物、下游引物、探针、阳性对照、阴性对照。

1）引物及探针：通过选取山羊关节炎-脑炎病毒基因组的CA基因作为PCR扩增的靶序列，设定合成特异性的引物和TaqMAN-MGB探针；其序列为：

CAF1：5-CAGTGGATCAGATTATGG-3

CAR1：5-TGCTCTTAAGGCTATTATTAC-3

CAP1：5-FAM-AATCAAGCAGCAGCACAAGC-TAMRA-3

2）阳性对照：为含有目标扩增序列的阳性对照质粒pGEM T-CA质粒；通过人工合成一段含有扩增靶序列的基因片段，与pGEM T载体连接，转化DH5α大肠杆菌，挑选及鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，用去离子水溶解即得。

3）阴性对照：为提取的正常山羊外周血淋巴细胞基因组DNA；通过将山羊抗凝血以淋巴细胞分层液分离外周血淋巴细胞，然后用市售的血液基因组提取山羊外周血淋巴细胞基因组DNA，用去离子水溶解即得。

本发明试剂盒中的PCR反应液可以选择为：1X实时荧光PCR预混液、10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物、10pmol/μL探针，反应总体积为25μL，也可按比例调整为50μL；

PCR反应条件为50℃,2min；1个循环；95℃，2min；1个循环；95℃，15s；60℃，30s；40个循环。

测定和判定：

选择荧光检测模式FAM荧光，将3～15循环的荧光信号值定为基线，基线标准差的10倍定义为阈值，荧光信号值达到阈值时的PCR循环数定义为Ct值。当Ct值在10～35之间时，被认为是可信的，判定结果为阳性。

本发明的优点和特点是：