[发明专利]一种测定富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体为准确测定鸡肉、猪肉及其饲料中四环素类抗生素残留的方法。

背景技术

近年来，四环素类抗生素作为一类广谱抗生素，因其价格低、抗菌谱广、饲料报酬高等优点而在养殖业上被广泛地应用。其中土霉素、四环素、金霉素及强力霉素应用最多。四环素类抗生素进入机体后，一部分经过代谢反应生成无活性的产物，一部分则以原形及活性代谢物排到体外进入环境。人若长期摄入四环素残留超标的食品或长期生活在含有这些残留抗生素的环境中，会导致耐药菌的滋生，危害人体健康。因此，食品及环境中四环素等典型兽药残留的准确测定受到越来越多的关注。

针对含有四环素类抗生素的实际样品，人们提出了多种样品前处理方法和检测方法。马丽丽等采用液相色谱串联质谱测定了土壤中的土霉素、四环素、金霉素，其回收率在62.2％-85.4％之间(分析化学，2010，38(1)：21-26)；孙刚等也采用类似方法，测定了畜禽粪便中的土霉素、四环素、金霉素，三种抗生素的加标回收率介于51.3％-93.7％之间(环境化学，2010，29(4)：739-743)。由于生物样品基质成分复杂，干扰物质多，且通常四环素类抗生素在样品中的残留浓度很低，因此需采用适当的前处理方法来净化样品和消除干扰。邱彬等采用pH3.5的Mcllvaine-Na₂EDTA缓冲液，振荡离心提取、C18固相萃取柱净化除杂等前处理方法，再结合液质联用技术测定了鳗鱼中的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素，其测定下限为10.0mg kg^-1(中国发明专利，CN102998159A)；伍钧等利用高效液相色谱测定了土壤中四环素类抗生素残留量，试样经pH4.0Mcllvaine-Na₂EDTA缓冲液提取，后用HLB固相小柱净化和富集，其加标回收率为81.7％(中国发明专利，CN102401818A)。

然而，对于富含蛋白质的动物组织及动物饲料样品，由于四环素类抗生素与蛋白质之间存在明显的相互作用，采用缓冲溶液直接提取的前处理方法，无法将样品中与蛋白质强烈结合的四环素类抗生素提取完全，需要再利用三氯乙酸等有机酸沉淀去除蛋白质。尽管三氯乙酸能高效沉淀蛋白，但在沉淀过程中与蛋白质结合紧密的四环素类抗生素，会与蛋白质一同被沉淀，无法被提取，造成测定结果仍然偏低。例如，Fedeniuk等人采用高效液相色谱法测定不同样品基质中土霉素含量时发现，对水样中土霉素的回收率可高达90％；而在猪肉组织中的土霉素时，回收率却很低，不到70％。他们认为是猪肉组织中的蛋白质等成分影响了四环素的测定(J.Chromatogr.B，1996，677，291-297)。Cherlet等人用三氯乙酸除蛋白、采用液质联用技术测定猪组织中的四环素类抗生素时，发现这些抗生素的回收率都很低，均小于25％，其中强力霉素的回收率最低，只有7％(Anal.Chim.Acta，2003，492，199-213)。因此，针对富含蛋白质的动物组织及鸡饲料样品，必需开发一种有效去除蛋白质且能准确测定其中四环素类抗生素含量的新方法。

发明内容

本发明的任务是提供一种检测富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法，即结合液相色谱技术，建立一种高效、准确的测定富含蛋白质样品中四环素类抗生素的方法，使其具有简便、快速、回收率高的除蛋白方法，以克服现有检测四环素类抗生素方法回收率严重偏低，不能满足分析要求的不足。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的检测富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法，包括以下步骤：

(1)绘制四环素类抗生素液相色谱串联质谱法标准曲线，浓度范围为0.4mgL^-1-1.5mg L^-1；

1、一种测定富含蛋白质的样品中四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：

(1)绘制相应的四环素类抗生素液相色谱串联质谱法标准曲线。

(2)取待测的含蛋白质的液体样品或含水分的含蛋白质的固体样品或干燥的含蛋白质的固体样品用lowery法测定样品中蛋白质的含量。

(3)酶解法除蛋白：称取经步骤(2)测得蛋白质含量的待测的含蛋白质的样品，按所称取样品中蛋白质摩尔量五十分之一的比例加入胰蛋白酶溶液，80W超声8min或100W超声酶解6min或120W超声4min，得到酶解液；