[发明专利]水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于环境质量安全检测技术领域，涉及一种水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量检测方法。

背景技术

孔雀石绿属于一种工业染料，在水产养殖中经常用来治疗水霉病、腮霉病以及环境的消毒等。研究表明孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿在动物体内消除缓慢，残留时间长，且具有致癌、致畸和致突变作用，欧美很多国家以及我国农业部公告第235号文件都将孔雀石绿列为禁止使用药物，规定在动物源性食品中不得检出。目前水产养殖中违规使用孔雀石绿的现象已得到各级政府部门的有效控制，但仍有少数渔民在使用孔雀石绿，再加上曾经孔雀石绿被广泛应用，对部分水产养殖环境已造成了污染，导致部分养殖环境水体中会残存孔雀石绿类药物，为后续的水产养殖带来安全隐患。此外，在部分水产品的市场流通环节中也会因为鱼体保活需要，一些非法分子在暂养水体中加入孔雀石绿。实际检测工作中也经常发现未使用孔雀石绿类药物进行疾病治疗的水产品也能检出孔雀石绿及其代谢物的存在。以上情况的存在一定程度上给水产品质量安全问题溯源工作带来麻烦。因此监测水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量水平对了解养殖环境安全状况、排查水产品中孔雀石绿污染来源和水产品质量安全监管工作具有积极意义。目前针对水产养殖环境水体中的痕量孔雀石绿及其代谢物检测方法的研究较少。如何通过有效地样品前处理技术和仪器分析技术，建立一种样品富集程度高、回收率高、重现性好和精确度高的水产养殖环境水体中孔雀石绿类残留检测方法成为研究的关键。

碳纳米管（Carbon nanotubes, CNTS）作为新型的功能性材料，在物理、化学和生物等领域得到了广泛应用。CNTS具有很强的吸附能力，可通过π—π作用力、范德华力和疏水相互作用等非共价作用力与目标物分子结合，具有高比表面积、良好的化学、机械稳定性和热稳定性等优点，可作为优良的气相色谱、毛细管电泳及高效液相色谱柱填充材料，也可作为吸附材料用于富集有机污染物、金属离子和生物大分子。由于CNTS材料具有的良好性能和低廉的价格优势，目前已有文献报道CNTS中的多壁碳纳米管（MWCNTS）用于水体中有机磷、有机氯、农药等样品的前处理和净化中。将多壁碳纳米管材料更多地用于兽药残留检测工作中对于拓展兽药残留前处理技术也具有积极的意义。孔雀石绿的检测技术有液相色谱和液相色谱-质谱联用。通过丙磺酸阳离子交换固相萃取柱或氧化铝固相萃取柱净化后，实现液相色谱—荧光检测、液相色谱—紫外检测和液相色谱—质谱联用分析检测。液相色谱法前处理复杂、耗时、检出限高和不利于准确定量和定性分析。水产养殖环境水体基质成分复杂，且污染物含量较低，若样品前处理过程中杂质去除不好，直接会干扰仪器的测定结果，因此将高效且成本低廉的碳纳米材料用于样品前处理技术是本发明的目的。

发明内容

本发明的目的是克服现有分析方法的不足，能找到一种快速、准确且成本低廉的养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物的测定方法，以实现水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物的定量及定性分析测定。

本发明方法包括以下步骤：⑴样品预处理、⑵固相萃取富集净化、⑶液相色谱—质谱检测，各步骤的操作方法如下：

⑴样品预处理：准确移取经过滤后的水样20～50mL，加入10ng氘代孔雀石绿和10ng氘代隐色孔雀石绿，加入色谱纯甲酸使其体积分数为0.04～0.10%。

⑵固相萃取富集净化：在3mL聚乙烯固相萃取小柱（SPE专用空柱）底部先放置一层孔径20μm石英砂滤芯筛板，加入20～60mg多壁碳纳米管材料（直径40～60nm，长度5～15μm，纯度＞95%，灰分≤2%，比表面积为40～300m²/g），上面再放置一层20μm滤芯筛板，通过调节上层滤芯筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.5～0.6cm；制作完成的多壁碳纳米管固相萃取柱先用5mL甲醇和5mL纯水润洗活化，然后将预处理后的水样全部转移至固相萃取柱中，控制流速在1.0mL/min；再向固相萃取柱中加入5mL纯水淋洗，弃去以上全部流出液；最后向固相萃取柱中加入5%甲酸乙腈4～6mL进行洗脱，收集洗脱液于10mL试管中。