[发明专利]一种集成检测9种啤酒污染菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于啤酒技术领域用于啤酒污染菌检测方法，特别涉及一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳分离技术，用于啤酒中常见污染菌检测的高通量、半定量分析方法。 

背景技术

啤酒的酿造过程是建立在纯啤酒酵母的发酵和对污染微生物控制的基础上的，啤酒中主要的污染微生物是带有抗酒花基因的乳酸菌，对于此类微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多数啤酒厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法及时指导生产技术人员对啤酒生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品啤酒质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物。 

多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加入两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，具有高效、高通量的特点，同时可以降低检测成本。目前多重PCR技术已经在食品检测及病原体诊断等多个方面得到广泛应用，但由于易造成啤酒污染的乳酸菌种类多且同源性较高，需在各自种内保守区域逐一设计特异性引物，且由于多对单引物组成的多重PCR引物体系的设计规则复杂，设计过程需平衡引物体系内各单引物浓度，同时优化反应体系、调整扩增程序以保证多对引物的同步扩增，且受后期PCR产物在凝胶电泳中分辨率的限制的影响，目前的多重PCR反应至多只能做到5-6重PCR，仍无法满足近十种啤酒污染菌的高通量的检测需求。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，克服常规啤酒中污染菌检测技术操作繁琐，费时耗力以及检测种类少等不足，提供一种由9对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程多种常见污染菌进行高通量、半定量的扫描式检测。 

为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下： 

由于啤酒中主要的污染微生物是带有抗酒花基因的乳酸菌，本发明针对表1所述9种常见污染菌进行扫描式检测。 

一种集成检测9种啤酒污染菌的方法，采用9重PCR一次性同时扩增9种污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillus paracollinoides、林氏乳杆菌Lactobacillus lindneri、有害片球菌Pediococcus damnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcus clausenii，再通过毛细管电泳分离所述9重PCR的扩增产物，所述9重PCR反应中应用引物SEQIDNO.1-18。 

本发明一种集成检测9种啤酒污染菌的方法，所述方法具体步骤如下： 

（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取： 

将检测样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取培养液离心收集细胞沉淀；加入50mM EDTA480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板； 

（2）多重PCR扩增 

PCR引物体系用于9种常见啤酒污染菌的定性检测，由于乳酸菌在16SrDNA序列的高度保守性，因此本发明在各菌种此区域设计种内特异性引物，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-18，20ul PCR反应体系：200nM正向混 合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl₂4ul，5×PCR Buffer 4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温； 

表1本发明设计的用于啤酒污染菌鉴定到种的9重引物体系各引物序列 

（3）毛细管电泳分离条件 

分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bp DNA Marker 0.5ul混合均匀；在50℃、6.0KV电压下，分离35min；