[发明专利]一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法

权利要求书

1.一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于，制备步骤如下：

(1)种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：

第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到10ml LBA培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600＝0.8-1.0，得到一级种子培养液；

第二次扩增：将一级种子液按5％-10％的接种量接种至100ml LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600＝0.8-1.0，即得二级种子液；

第三次扩增：将二级种子液以3％-7％的接种量接入1.5L LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600＝0.8-1.2，即得发酵工作种子液；

(2)发酵前准备：罐体及管道灭菌，配制培养液，在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15％酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；

(3)发酵：控制发酵条件，发酵温度30-37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量25-30％，调节转速为150-250rpm，每隔两小时转速提升20-30rpm，当OD600＝20-22时，开始用蠕动泵加入补料培养基，进行补料，补料的流加速度为6-7ml/min；

(4)诱导：当OD600＝30-32时，开始添加IPTG 10-12ml进行诱导，诱导表达结束后，收集菌液，离心，分离，即得目的菌体；

(5)上述培养基组成为：

LBA培养基：每升H₂O中蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；

发酵培养基：A液：每升H₂O中含KH₂PO₄ 25-40g、K₂HPO₄·2H₂O 57.5-80g、(NH4)₂SO₄17.5-25.8g、FeSO₄·7H₂O 0.008-0.015g；

B液：每升H₂O中含CaCl₂·2H₂O 0.8-1.6g、CoCl₂·6H₂O 1.60-2.93g、CuSO₄·5H₂O 1.5-2.5g、FeSO₄·7H₂O 1.80-2.87g、MnSO₄·H₂O 1.0-1.93g、Na₂MoO₄·2H₂O 1.60-2.67g；

C液：每升H₂O中含20％酪蛋白25.0-41.67ml、1M MgSO₄ 16.67-36.67ml、50mg/ml卡那霉素10.0-23.33ml、70％葡萄糖600-1000ml、40％(NH4)₂SO₄ 80-120ml、5％柠檬酸1.67-5.0ml；

补料培养基：D液：每升H₂O中含20％酪蛋白1.67-2.22ml、1M MgSO₄ 10.42-17.36ml、50mg/ml卡那霉素0.56-1.11ml、A液55.56-83.33ml、70％葡萄糖208.33-347.22ml、40％(NH4)₂SO₄ 20-30ml、水518.76-703.46ml。

2.根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵罐为19L发酵罐，所述酵母提取液浓度为12％-18％。

3.根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中发酵时间为22-26小时。