[发明专利]编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因及其应用

权利要求书

1.一种编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因，其特征在于包含编码轻链的核苷酸序列和编码重链的核苷酸序列：编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因的应用，其特征在于：是将如SEQ ID NO.1所示的编码轻链的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的编码重链的核苷酸序列分别克隆到CHO细胞表达系统上，再共同转染CHO细胞，发酵，诱导表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体；所述的CHO细胞表达系统为真核表达载体和真核表达载体

3.一种表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，其特征在于：含有权利要求1所述的编码轻链的核苷酸序列和编码重链的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，其特征在于通过如下步骤得到：

（1）分别在如SEQ ID NO.1所示的编码轻链的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的编码重链的核苷酸序列的5’端设计上信号肽和起始密码子，再分别在3’端设计上终止密码子，具体如下所示：

设计有信号肽、起始密码子和终止密码子的编码重链的核苷酸序列，命名为PH-H1序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

设计有信号肽、起始密码子和终止密码子的编码轻链的核苷酸序列，命名为PH-L1序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）通过基因合成，得到如步骤（1）所示的PH-H1序列和PH-L1序列；

（3）以PH-H1序列和PH-L1序列为模板，使用PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶，通过如下引物分别PCR扩增得到带有突出A碱基的PH-H1序列的PCR产物和带有突出A碱基的PH-L1序列的PCR产物；

重链引物F1：5'-ATGGAGTTCTGGTTGTCATGGG-3'；

重链引物R1：5'-TCATTAGCCAGGCGAAAGGGAGAGC-3'；

轻链引物F2：5'-ATGGATATGCGAGTACCCGCACAAC-3'；

轻链引物R2：5'-TCATTAACACTCCCCGCGATTGAACG-3'；

（4）将带有突出A碱基的PH-H1序列的PCR产物与载体连接，得到pOptiVEC-Prot-PH-H1重组载体；将带突出A碱基的PH-L1序列的PCR产物与载体连接，得到pcDNA3.3-Prot-PH-L1重组载体；

（5）将pcDNA3.3-Prot-PH-L1和pOptiVEC-Prot-PH-H1共同转染至CHO细胞，得到表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞。

5.根据权利要求4所述的表达重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的CHO细胞，其特征在于：

步骤（3）中所述的PCR后能在得到的产物3'端添加A碱基的酶为LA Taq酶；

步骤（3）中所述的PCR扩增的条件如下：

①当模板为PH-HC序列，PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1.5分钟，34个循环；72℃延伸5分钟；

②当模板为PH-LC序列，PCR扩增的条件为：94℃3分钟；94℃15秒、57℃30秒、72℃1分钟，34个循环；72℃延伸5分钟。