[发明专利]作为鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株免疫佐剂的鞭毛蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鞭毛蛋白作为鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株免疫佐剂，可有效增强疫苗的免疫应答。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种禽类急性高度接触性传染病，严重威胁着养禽业。一般使用灭活苗和弱毒苗进行免疫预防，效果确实，在疾病的防控中发挥巨大的作用。

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白，由4个球形结构域（D0，D1，D2和D3）构成，其中D0和D1结构域高度保守。胞外鞭毛蛋白被TLR5分子识别后，通过接头蛋白MyD88活化下游分子，最终激活NF-κB信号通路，在转录水平上调节多种前炎性因子基因的表达。研究表明，鞭毛蛋白作为固有免疫的诱导剂，诱导产生的固有免疫应答可启动针对外源抗原的获得性免疫应答，显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的效应（Mizel SB,Bates JT.Flagellin as an adjuvant:cellular mechanisms and potential.The Journal of Immunology,2010,185(10):5677-5682）。最近研究显示，以沙门菌鞭毛蛋白作为佐剂，与禽流感病毒颗粒联合免疫后，可促进鸡产生更强的黏膜免疫应答（Chaung HC,Cheng LT,Hung LH,Tsai PC,Skountzou I,Wang B,Compans RW,Lien YY.Salmonella flagellin enhances mucosal immunity of avian influenza vaccine in chickens.Veterinary Microbiology,2012,157(1-2):69-77）。本实验室构建出沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)，采用酸裂解提取该菌的鞭毛蛋白，与OVA混合免疫6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，可提高OVA特异性抗体的水平（《一种可用作免疫佐剂的改良型鞭毛蛋白及其制备与应用》，中国专利申请，公开号：CN103044530A）。

发明内容

本发明的目的是将鞭毛蛋白作为一种佐剂，添加到商品化的鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株中，增强机体的免疫应答。

本发明所述的鞭毛蛋白，是从沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)中提取。宿主菌经IPTG诱导后，可在细菌表面长出重组鞭毛。经酸裂解法提取，可得到高纯度的野生型鞭毛蛋白（FliC），与商品化的鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株混合后，滴鼻免疫1周龄的SPF鸡，可提高新城疫抗体水平，具有良好的疫苗免疫佐剂应用前景。

附图说明

图1．SDS-PAGE分析重组鞭毛蛋白。M.蛋白Marker；1.FliC。

图2．3免14天后血清中IgG抗体水平。

图3．3免14天后血凝抑制抗体滴度。

具体实施方式

一、沙门菌鞭毛蛋白的制备

沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)鞭毛蛋白的提取程序为：沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)单菌落接种10mL M-broth，37℃静置培养16～18h后以1:100比例将培养液转接种于500mL M-肉汤中，37℃静置培养16～18h；3000rpm离心收集细菌，PBS洗1次，20mL PBS重悬；使用1N HCl调pH至2.0，室温150rpm振荡30min裂解细菌；10000rpm，离心20min去除细菌碎片；取上清18000rpm，离心l h，去除杂质；上清用1N NaOH溶液调pH至7.2；冰浴条件下，将上清置于磁力搅拌器上缓缓加入饱和硫酸铵，至饱和度达到67%。之后，4℃过夜，15000rpm离心30min；5mL PBS重悬沉淀，在PBS缓冲液中4℃透析48h，每隔12h换一次PBS缓冲液；蛋白经SDS-PAGE分析，大小约为50KD（图1）。应用ProteoSpin^TMEndotoxin Removal Maxi试剂盒去除所提取鞭毛蛋白的内毒素。

二、疫苗

商品化的鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株（兽药生字（2011）170262007，批号20120102），由武汉中博生物股份有限公司生产。

三、动物免疫及抗体检测

1．动物免疫