[发明专利]热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体，其源于博伊丁假丝酵母的野生型甲酸脱氢酶，能够催化辅酶NADH循环再生，与野生型甲酸脱氢酶相比表现出更高的热稳定性，具有选自以下特征中的一个或多个突变：I98V、V152I、A154D、D158R。

2.根据权利要求2所述热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.4。

3.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-2中任一项所述的重组多肽。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.3。

5.一种重组质粒，其包括表达载体连接权利要求4所述的多核苷酸，所述载体序列为SEQ ID NO.5。

6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌，为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。

8.根据权利要求6或7所述的宿主细胞，其中所述重组质粒的密码子已经为在所述宿主细胞中表达而进行了优化。

9.一种如权利要求1~8所述甲酸脱氢酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(a)采用博伊丁假丝酵母构建表达甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及甲酸脱氢酶突变体基因，所述宿主细胞为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备甲酸脱氢酶突变体。  

10.根据权利要求9所述的甲酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中30℃，250rpm过夜培养，次日取三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养12h；

所述第一培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L；

所述第二培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。

11.一种NADH循环再生方法，包括在与权利要求1-2任一项所述的甲酸脱氢酶突变体的存在下，将NAD催化生成NADH。