[发明专利]piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法

权利要求书

1.一种piggyBac转座子表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、以SEQ ID NO:5的质粒为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，PCR扩增出序列为SEQ ID NO:3的含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；

(2)、分别用SalI酶切步骤1的loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大培养，提取阳性克隆的质粒，SalI进行酶切鉴定，得到piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列为SEQ ID NO:4。

2.根据权利要求1所述的piggyBac转座子表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min。

3.权利要求1或2所述的构建方法构建得到的piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列为SEQ ID NO:4。

4.一种piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将权利要求3所述的表达载体与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；

(2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到piggyBac转座子的转基因猪。

5.根据权利要求4所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述共转染的步骤为：

（1）、把表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000μLI中，混匀；

（2）、加入7μL用前混匀的PLUS^TMReagents，混匀后静置5min；

（3）、加入21μL用前混匀的Lipofectamine^TMLTX，混匀后静置30min；

（4）、用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。

6.根据权利要求4或5所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。

7.根据权利要求4或5所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为：

转染48小时后，弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500μg/mLG418筛选浓度培养基4mL，隔天换液，置于39℃，5%CO₂，饱和湿度继续培养至有单个的细胞克隆出现时，分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得单克隆转基因细胞系。

8.权利要求4-7任一项所述的构建方法构建得到的piggyBac转座子的转基因猪。