[发明专利]一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法

说明书

技术领域

本发明属于血清学诊断领域，涉及禽戊肝病毒ORF2重组蛋白（aHEV-ORF2-268）,识别该蛋白的单抗1H5及检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法。

背景技术

禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）是鸡的大肝大脾病（Big liver and spleen disease，BLS）或肝炎脾大（Hepatitis-Splenomegaly，HS）综合症的主要病原，主要感染30-72周龄的蛋鸡和肉种鸡，引起鸡的死淘率升高和产蛋率下降，部分鸡腹部充血，卵巢退化，偶有肝脾肿大。

2001年Haqshenas等学者首次对禽HEV的基因组进行了描述，随后欧洲、澳大利亚也都描述了禽HEV本国分离株的基因序列。通过序列分析发现，禽HEV与人、猪HEV的同源性仅为50%左右，但是与哺乳动物的HEV在遗传性和抗原性上是有一定相关性的；另外，禽HEV分为3个基因型，这种分型似乎与地域相关，但是其血清型可能只有1个。

2010年国内首个禽HEV分离株的全基因组序列被描述，发现与其欧洲的分离株同源性较高98%，与美国和澳大利亚的为82%左右，并且属于禽HEV基因3型。

目前为止，禽HEV一直没有合适有效的体外培养系统，因此对该病毒的诊断通常是通过RT-PCR检测病毒的核酸和间接ELISA检测血清中的抗体。

关于血清学的ELISA诊断技术，美国的研究学者利用禽HEV当地分离株，原核表达该分离株的衣壳蛋白的后半段建立了禽HEV抗体检测的间接ELISA方法，但是该方法仅限于实验室用，并没有商业化合推广使用，另一方面该ELISA方法所用的抗原是用基因2型禽HEV分离株的衣壳蛋白建立的，而国内禽HEV的分离株是基因3型，目前尚未有抗原是用基因3型禽HEV分离株的衣壳蛋白建立抗体检测的ELISA方法。

目前，国内外还没有检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体阻断ELISA方法的报道。

发明内容

本发明的目的提供原核表达的禽戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端268个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明的另一目的是利用禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis E virus from China,CaHEV,Genbank number GU954430)ORF2蛋白的单抗1H5和上述蛋白，提供一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法。

利用国内禽HEV分离株的衣壳蛋白建立抗体检测的ELISA方法。而ELISA方法中，单抗阻断ELISA或竞争ELISA因能排除包被抗原中的杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性。

本专利所描述的方法即是采用间接包被抗原的单克隆抗体阻断ELISA方法。其特点在于，利用单克隆抗体具有高度均质性和高度特异性的特点，以特异性单克隆抗体作为检测抗体，使得该方法更加特异与敏感，而且可以用于检测多种易感动物的血清，不同于间接ELISA方法，每种动物血清都要配备相应的酶标抗体。因此，本专利相对间接ELISA方法而言具有在方法学上的优越性。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一方面，一种编码禽戊型肝炎病毒中国分离株（Hepatitis E virus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430）衣壳蛋白的氨基酸序列，其特征在于，禽戊型肝炎病毒中国分离株的ORF2蛋白C端268个氨基酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。

本发明的第二方面，一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是原核表达的重组蛋白，名称为aHEV-ORF2-268，作为蛋白包被抗原，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。该蛋白包被抗原是通过基因工程技术制备，其原核表达、鉴定、纯化方法详见实施例1。

本发明的第三方面，一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是aHEV-ORF2-268的特异性抗体，名称为单抗1B5。单抗1B5是将重组蛋白免疫BABL/c小鼠，通过传统的杂交瘤细胞技术制备的，具体方法详见实施例2。

本发明的第四方面，一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）在96孔酶标板上加入200ng/孔的原核表达的重组蛋白aHEV-ORF2-268，包被缓冲液为0.1M PBS，4℃包被过夜，使用包含0.5%Tween-20的PBST洗板5次；

步骤（1）中，PBS的pH值为7.2。