[发明专利]植酸酶玉米BVLA430101转化体PCR检测的特异性引物和探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中转基因植物的分子生物学检测方法，特别是涉及植酸酶玉米BVLA430101转化体PCR检测的特异性引物和探针及其应用。

背景技术

玉米是我国重要的饲料加工原料，其所含总磷的50%以上是以植酸形式存在，动物几乎不能消化利用，同时，植酸是抗营养因子，严重影响动物对钙、镁、铁、锌等元素的吸收。植酸酶是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或盐)的一类酶的总称，能水解植酸最终释放出无机磷。在动物饲料中添加外源植酸酶可以改良磷酸盐的生物利用度，消除植酸的抗营养作用，不仅能减少磷在环境中的排泄，降低农业生态的负担，同时也能减少动物饲料中无机磷的添加，缓解我国磷资源匮乏的局面。

BVLA430101是中国农业科学院研发的转植酸酶基因玉米品系，将黑曲霉中植酸酶基因phyA2分离出并置于种子特异性启动子之下，加上定位蛋白信号肽，并以Bar基因作为筛选标记，构建到玉米特异表达载体上，得到的转植酸酶基因玉米经过6代选育，获得了27个表达植酸酶并能稳定遗传的转基因玉米纯合系。其种子中植酸酶活性在1000U kg^-1以上，可以替代传统工业生产的植酸酶添加剂。

目前，植酸酶玉米BVLA430101于2009年11月获得农业部正式颁发的转基因生物生产应用安全证书，成为我国首例获得安全证书的转基因玉米，也是国际上首例研制成功的转植酸酶基因玉米，标志着转植酸酶基因玉米在我国即将进入大规模商业化生产阶段。根据《农业转基因生物标识管理办法》规定，转基因产品必须进行标识管理，因而需要加强转植酸酶基因玉米相关的检测技术。

转基因植物及其产品的PCR检测主要是对转基因植物外源插入片段的选择性扩增。针对外源插入核酸片段不同的位置和元件进行PCR扩增，其特异性及检测范围有很大的区别。根据扩增的目标核酸的位置的不同，PCR检测策略可以分为四种，即筛选PCR检测(Screen PCR)、基因特异性PCR检测(Gene-Specific PCR)、构建特异性PCR检测(Construct-Specific PCR)和转化体特异性PCR检测(Event-Specific PCR)。转化体特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区DNA序列实现的。由于每一个转基因植物转化体都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区DNA序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以转化体特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。鉴于上述四种转基因检测策略的优缺点，转化体特异性PCR检测已经成为目前转基因检测方法研究的重点，并逐步地为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。

经过对现有文献检索，发现已有植酸酶玉米基因特异性(phyA2)检测方法的报道，专利CN101792812A中公开了一种植酸酶基因玉米BVLA430101转化体特异性定性PCR检测方法，但无法得到植酸酶玉米的准确含量，不利于加强转基因产品的标识管理。目前，国内外还没有针对植酸酶玉米BVLA430101转化体检测的荧光定量PCR和荧光探针检测的方法。本发明的建立可填补国内外相关领域的空白。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种植酸酶玉米BVLA430101转化体PCR检测的特异性引物和探针及其应用，主要是实现实时荧光定量PCR检测，克服了现有方法特异性不强、技术不够先进的缺点。

本发明所采用的方法是：

一种植酸酶玉米BVLA430101转化体特异性引物，正向、反向引物序列分别为：

BVLA430101-1F:5'-CACTGCCCGCTTTCCA-3'

BVLA430101-2R:5'-TGGGCACATACCTAGTGACTGTA-3'。

一种植酸酶玉米BVLA430101转化体特异性探针，序列为：

BVLA430101-P:FAM-5'-CCTGTCGTGCCAGTCACTCAAATGTCTAC-3'-TAMRA。

探针的5'端标记荧光基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。

本发明涉及一种利用植酸酶玉米BVLA430101转化体特异性引物在定性检测植酸酶玉米BVLA430101的应用，所述方法如下：

(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用BVLA430101-1F和BVLA430101-2R引物组合进行PCR扩增；